甲醇营养型酵母表达系统的研究进展

甲醇营养型酵母越来越被人们用作外源基因的表达系统。本文综述其在表达质粒构建,表达株的筛选,表达产物的糖链加工以及它分拣外源蛋白进入过氧化物酶体等的特点,不仅具有广泛的商业用途,而且在理论研究特别是膜蛋白结构与功能方面也有潜在应用价值。     

人纤溶酶原激活剂抑制物2型(PAI-2)在Pichia pastoris中的表达

用ＰＣＲ方法从ｐＰＡＩＪ．７中扩增人纤溶酶原激活剂抑制物２型（ＰＡＩ－２）基因,与ｐＰＵＣ１８重组,经限制性内切酶片段分析与核苷酸序列分析,获得全长人ＰＡＩ－２基因．ＰＡＩ－２基因与表达载体ｐＰＩＣ９重组,构建受乙醇氧化酶１基因（ＡＯＸ１）启动子与转录终止区控制的酵母表达质粒,转化ＧＳ１１５宿主菌,经表型筛选和ＰＣＲ扩增筛选阳性克隆,用甲醇诱导表达,重组ＰＡＩ－２以分泌型表达,占分泌总蛋白的３０％,具ＰＡＩ－２抗原性,与低分子量尿激酶形成了抗ＳＤＳ复合物,具抑制纤溶的活性（９１．４ＡＩＵ／ｍｌ）．对培养条件也进行了探讨．     

Ⅰ型纤溶酶原激活物抑制剂cDNA在P.pastoris酵母菌中的表达和鉴定

将编码３７９个氨基酸残基的ＰＡＩ－１ｃＤＮＡ插入到含ＡＯＸ１启动子和ＰＨＯ１分泌信号肽序列的甲醇营养型酵母载体中,构建成表达质粒ｐＹＩＳ－１．表达质粒转化Ｐ．ｐａｓｔｏｒｉｓ甲醇营养型酵母细胞,筛选Ｈｉｓ＋Ｍｕｔ－表型的转化子,经低密度摇瓶培养,１％甲醇诱导表达７ｄ后,培液经ＳＤＳ－ＰＡＧＥ分析,ＰＡＩ－１生物活性测定和Ｗｅｓｔｅｒｎｂｌｏｔ证实表达出分子量为４３～５１ｋＤ的４条ＰＡＩ－１条带．表达的ＰＡＩ－１能有效地分泌到培液中,占培液总蛋白的２６％左右,达４ｍｇ／Ｌ培液;其比活性为１．１６×１０４ＡＵ／ｍｇ．不同分子量ＰＡＩ－１可能与其糖基化程度不同有关     

大肠杆菌表达的重组人PAI－1的纯化

纯化了工程细菌表达的可溶态和包含体形式的ｒｈＰＡＩ－１,纯度均达９８％,其ｒｈＰＡＩ－１蛋白质得率分别为１５％和１９％,比活性分别为３３５００ＩＵ／ｍｇ和２７７０００ＩＵ／ｍｇ。Ｎ端氨基酸序列分析显示,ｒｈＰＡＩ－１Ｎ端１５个氨基酸与天然ＰＡＩ－１完全一致;包含体复性研究表明,包含体的复性与复性蛋白的浓度及复性液中助溶剂的浓度密切相关。纯化的ｒｈＰＡＩ－１为分析ＰＡＩ－１结构与功能及探讨其临床应用提供了材料。     

T淋巴瘤侵袭转移诱导因子1的结构与功能

T淋巴瘤侵袭转移诱导因子1(T-lymphoma invasion and metastasis inducing factor 1，Tiam1)是Ras相关的C3肉毒素底物1(Ras-Related C3 botulinum toxin substrate 1，Rac1)的特异性鸟苷酸交换因子(guanine nucleotide ex-change factor，GEF)。在细胞外信号刺激下Tiam1可以促进Rac1从无活性的GDP结合状态向有活性的GTP结合状态转换，有活性的Rac1-GTP与不同的下游效应分子相互作用，从而影响多种细胞事件。     

大鼠丙酮酸激酶同工酶催化性质的比较研究

利用DEAE 纤维素柱层析分离大鼠组织匀浆105,000g 上清中的丙酮酸激酶(PyK)同工酶,发现肝和肾中存在L 及K 两型PyK,肝中以L 型为主,而肾中以K 型较多,L:K 的平均活性比值分别为6.07及0.248。但骨胳肌中只有M 型。用聚丙烯酰胺凝胶板电泳也可获得相似的同工酶谱。用硫酸铵沉淀结合层析又从大鼠红细胞中提取了R 型PyK,与上述三型一起,进行了催化性质的比较研究。结果如下:1.K 型对热极不稳定,而M 型对热最为稳定。2.L 型和K 型可利用GIP 代替ADP 作为底物,但GDP 作为底物时的酶活性远小于ADP 作底物时的活性。M 型利用GDP 的能力很小,而R 型几乎可忽略不计。3.某些氨基酸可抑制PyK,K 型PyK 对氨基酸的抑制最为敏感,可使其抑制的氮基酸最多,而M 型最不敏感,在测定的12种氨基酸中仅受苯丙氨酸抑制,L 型与R 型介于上述两型之间,可使它们抑制的氨基酸种类相似。4.氨基酸对PyK 的抑制作用与它们代谢途径中成糖或成酮的关系尚不明确,而与其结构有密切关系。能抑制PyK 的氨基酸主要是非极性氨基酸,如丙、正丁、脯、苯丙氨酸等,当这四种氨基酸的侧链羟化成相应的丝氨酸、苏氨酸、羟脯氨酸或酪氨酸后,其抑制作用明显减弱或消失。5.小侧链的脂肪族氨基酸(如半胱、丙、正丁)对L 型PyK 的抑制作用强于大侧链的芳香族氨基酸(苯丙、酪);但对K 型PyK 的抑制却弱于大侧链芳香族氮基酸。并且L 型对小侧链氨基酸的敏感性大于K 型,而对大侧链氨基酸的敏感小于K 型。6.丙氨酸对L、R、K 三型PyK 的抑制作用与其α-氨基和直链结构有密切关系,其中α-氨基尤为重要。7.果糖-1,6-二磷酸(FDP)能激潘R 及K 型PyK,当底物PEP 处于低浓度时,尚可激活L 型。FDP 还能逆转各种氨基酸对四型PyK 同工酶的抑制作用,其中对R 及K 型的逆转效果较大。FDP 对各种氮基酸抑制的逆转效应并不相同。8.丝氨酸可显著激活K 型PyK,也可逆转氨基酸对K 型PyK 的抑制作用,其逆转效率仍因氪基酸而异,但其激活作用与FDP 不能相加。对上述结果作了讨论,认力这些PyK 同工酶催化性质的差异可有助于鉴定未知样品中的同工酶类型。还提出一个PyK 同工酶上有两类氨基酸结合点的假说。     

抗组织型纤溶酶原激活剂(tPA)单克隆抗体的制备和鉴定

用从人黑色素瘤细胞培液中提纯的tPA为抗原,通过杂交瘤技术获得TA₁,TA₂、TA₃和TA₄ 4株阳性杂交瘤细胞。经葡萄球菌A蛋白(SPA)亲和层析纯化抗tPA单克隆抗体(tPA．McAb)。固相酶联免疫吸附测定(ELISA)诱生含McAb的小鼠腹水,其效价达I：1O⁵。这些tPA McAb均属IgG₁亚型,特异地作用于tPA(包括基因工程生产的rtPA),与尿激酶(uK)无反应。用底物显色法测定表明所有tPA McAb均可抑制tPA的活性。     

人纤溶酶原激活剂抑制物2型(PAI-2)在大肠杆菌中的表达和分离纯化

用ＰＣＲ方法从ｐＰＡＩＪ．７中扩增人纤溶酶原激活剂抑制物２型（ＰＡＩ－２）ｃＤＮＡ,与ｐＵＣ１８重组,经限制性内切酶片段分析与核苷酸序列分析,获得全长人ＰＡＩ－２ｃＤＮＡ．ＰＡＩ－２ｃＤＮＡ与原核表达载体重组,构建原核表达质粒并转化大肠杆菌．经温度诱导表达,重组ＰＡＩ－２占全菌总蛋白的１４％,以可溶性形式存在,具纤溶抑制活性．工程菌发酵、压榨后,用硫酸铵分级沉淀,沉淀物经分子筛、离子交换和疏水性色谱的分离,每升菌液可获得约３０ｍｇ纯度达９０％的蛋白质,比活性为１１８６６ＡＩＵ／ｍｇ蛋白质,得率为１９．２％．     

亲和层析纯化HepG2细胞分泌的PAI—1

本文报道用抗ＰＡＩ－１单克隆抗体（ＭｃＡｂ）亲和层析建立了纯化ＰＡＩ－１的简便方法。经免疫亲和层析,Ｓｅｐｈａｃｒｙｌ Ｓ２００凝胶过滤,从ＨｅｐＧ２细胞培液中分离到糖基化和非糖基化两种形式的ＰＡＩ－１,回收率为８４％,ＰＡＩ－１比活性为６．１×１０＾４ＩＵ／ｍｇ。糖基化ＰＡＩ－１分子量为５０ｋＤ,比活性５．８×１０＾４ＩＵ／ｍｇ。非糖基化ＰＡＩ－１分子量４３ｋＤ,占总ＰＡＩ－１３０％,仍具有ＰＡ     

ATF-PAI2CD融合蛋白基因在毕赤酵母中克隆、表达和鉴定

为了克隆尿激酶型纤溶酶原激活物 (uPA)的氨基末端片段与纤溶酶原激活剂抑制物 2型(PAI 2 )突变体所构成的融合蛋白基因 ,并在Pichiapastoris中表达 ,应用PCR获得了人ATF PAI2CD融合蛋白基因cDNA(简称ATF PAI2CD) ,将其克隆到酵母表达载体pPIC9K ,获得融合基因表达质粒pZWY ATF PAI2CD .该质粒转化毕赤酵母菌GS115 ,用G4 18 YPD平板筛选高拷贝转化子 ,然后用甲醇诱导表达 .工程菌用摇瓶发酵 ,表达产物ATF PAI2CD占培养液中总蛋白 5 0 %以上 .经硫酸铵沉淀、分子筛和离子交换层析纯化得到的目标表达产物纯度达 95 % .Western印迹检测具有PAI 2与uPA的免疫原性 ,经牛奶板法检测具有纤溶抑制活性 .经流式细胞仪 (FCM )检测 ,能与肿瘤细胞特异性结合 .结果表明 ,ATF PAI2CD融合蛋白成功地在毕赤酵母中表达 ,且具有抑制uPA及与肿瘤细胞表面uPAR特异性结合的双重功能 .提示该融合蛋白可能具有良好的应用前景 .