全人源抗肝癌噬菌体单链抗体库的构建与筛选鉴定

体外致敏并用EBV转化肝癌患者的PBMC．用PCR分别扩增VH和VL基因并组成ScFv基因．将ScFv基因与载体fuse5连接后,电击转化大肠杆菌MC1061,构建噬菌体呈现型ScFv库．用人肝癌细胞及人肝细胞对初级噬菌体抗体库进行亲和富集及phage-ELISA筛选．筛选获得的阳性克隆进行ELISA及免疫组化鉴定并测序．结果表明,经EBV转化的4例肝癌患者PBMC,ELISA检测均有抗肝癌抗体产生,经多次PCR,扩增出6种VH（γ、μ）和9种VL（κ、λ）基因,经连接组成54种ScFv基因．将ScFv基因与载体连接后,导入大肠杆菌MC1061,得到库容为1．0×10^8的初级噬菌体抗体库,全长ScFv基因的插入率为80％．用人肝癌细胞系HepG2和人肝细胞系QSG-7701对抗体库进行三轮正负淘选和富集后,从中随机挑取533个克隆进行ELISA筛选,得到179个阳性克隆,阳性率为33．6％．将179个阳性克隆进一步进行其他细胞系的鉴定,发现克隆A82对肝癌细胞系HepG2、人胚肾上皮细胞系HEK293呈强阳性反应,免疫组织化学结果显示与人肝细胞癌组织有特异性反应,而不与正常肝组织反应．且A82的相对亲和力为2．4mol／L,解离常数Kd为5．32×10^-9mol／L,显示其亲和力较高．对克隆A82进行测序分析,结果表明：A82全长742bp,含linker cDNA序列45bp,重链可变区基因与人胚系IgVH3-23有94.3％的同源性,轻链可变区基因与人胚系IgV4-2有94．9％的同源性,V．D．J分别属于VH3-23-D2-21-JH6-linker-V4-2-JL2．由上述结果可见,应用体外抗原致敏方法和EBV转化技术联合噬菌体抗体库技术,构建了库容量达1×10^8的全人源抗肝癌单链抗体库,通过细胞ELISA和免疫细胞化学鉴定,获得的噬菌体抗体克隆A82具有较强的特异性,为肝癌的临床诊断及导向治疗奠定了基础．     

小球藻纯种室内模拟培养初探

实验以小球藻为藻种, 构建室内模拟培养装置, 在选定的一组优化的光照、温度和营养盐浓度条件下,采用间歇培养+连续培养的方式对其进行单种群培养, 模拟藻类生物量积累的过程。将培养期划分为5个阶段, 通过分析各阶段的光合荧光参数以及藻细胞内C、N、P含量, 初探生物量积累过程中藻生理参数的变化特征, 为研究水华的发生、维持和消退提供一定的参考。结果显示: 调整期, 藻生长不受生境光热、营养盐限制, 小球藻光合活性较强; 对数生长期, 藻类开始出现光抑制, 热耗散增加, 胞内N、P含量及N/P值较高; 对数生长期和稳定期, 藻同时受光抑制和营养盐抑制, N和P含量、N/P值均下降; 连续培养期, 营养盐限制得到缓解, 小球藻光合活性开始升高, 且藻细胞对N、P营养物吸收能力增强。监控藻类生物量积累过程中细胞内氮磷下降的拐点和细胞内元素比例变化可为预测水华的消退提供一定的参考依据。     

海南龙血树种群的年龄结构及分布格局

通过调查石灰岩及花岗岩两种不同生境样地内海南龙血树分布和胸径/基径情况,分析其龄级结构,用相邻格子法对海南龙血树进行每木调查,并采用方差/均值比率法和丛生指数(I)、负二项参数(K)、平均拥挤度(m*)、聚块性指数(PAI)、聚集指数(Ca)等聚集强度指数对海南龙血树种群分布格局进行分析。结果表明:石灰岩及花岗岩样地内的海南龙血树种群皆呈衰退型,其中天安乡、江边乡两样地种群的幼苗储备不足,昌化镇及东澳镇两地的中龄级植株数量稀少,大小洞天样地的种群年龄结构不完整;石灰岩样地内的海南龙血树种群在不同尺度、不同阶段上主要表现为集群分布,花岗岩地区种群的不同组分在不同取样尺度上分布格局相同,幼龄树、中龄树、老龄树的分布格局分别为集群分布、均匀分布、集群分布。     

"调神畅志"针刺法对帕金森伴便秘模型大鼠结肠组织5-HT4R及CaM-MLCK信号通路影响的研究

摘要 目的：探讨"调神畅志"针刺法对帕金森伴便秘(Parkinson''s disease with constipation)模型大鼠结肠组织中5-羟色胺4受体（5-HT4R）及钙调蛋白（CaM）-肌球蛋白轻链激酶（MLCK）信号通路影响的研究,并探讨其可能作用机制。方法：采用随机数字表将60只大鼠分为空白组、假手术组、模型组、西药组、常规针刺组、调神畅志针刺组,每组10只。模型组、常规针刺组、调神畅志针刺组颈背部皮下注射鱼藤酮的方法制造PDD大鼠模型,并用阿扑吗啡（APO）诱导检测。常规针刺组选取天枢、足三里、上巨虚及舞蹈震颤控制区,接电针,连续波频率15Hz,刺激强度2 mA,留针30分钟,1日1次,连续4周;调神畅志针刺组：选取王顺教授 " 调神畅志 " 三六九针法,百会透太阳、中脘、气海、足三里、太冲,采用连续波,头针频率45Hz,腹针频率30Hz,肢体针频率15Hz（体现调神畅志三六九针法的头针重、腹针中、四肢针轻的量化刺激）,刺激强度约2 mA,留针30 min,1日1次,连续4周;西药组采用美多芭、莫沙必利每日灌胃,连续治疗4周;模型组、假手术组：每日2 mL生理盐水灌胃,连续4周;空白组不予处理。采用Western blot法检测各组近端结肠组织中5-HT4R、CaM及MLCK蛋白表达以及含量水平。结果：与空白组相比,模型组大鼠近端结肠组织中5-HT4R、CaM及MLCK蛋白表达水平显著降低(P<0.01),与模型组比较,三个治疗组（西药组、常规针刺组、调神畅志针刺组）近端结肠组织5-HT4R、CaM及MLCK蛋白表达水平显著升高(P<0.01)。与常规针刺组相比,调神畅志组5-HT4R、CaM及MLCK蛋白表达水平明显升高(P<0.05)。结论：针刺可改善PD伴便秘大鼠模型便秘症状,且调神畅志针刺组优于常规针刺组,其作用机理可能通过调节大鼠结肠组织中5-HT4R蛋白表达以及激活CaM-MLCK信号通路来实现的。