转基因生防菌308R(pCPP430)对番茄根围菌群的影响

研究目的在于了解转基因生防菌308R(pCPP430)对番茄根围菌群代谢能力和群落结构的影响。实验中使用了两种互为补充的方法,即单一碳源利用测试(SCSU)和ERIC-PCR,对分别以308R(pCPP430)悬液、308R悬液和无菌水蘸根处理的番茄植株根围菌群进行比较。SCSU菌落计数的聚类分析表明,308R(pCPP430)和308R处理的根围菌重复之间相似性好,水处理的相似性差。主成分分析也得到了相同的结果。ERIC-PCR聚类结果表明,10种碳源,其中8种水处理和308R处理聚为一类。实验为生防菌与植物的互作提供一些依据,为根围菌群结构研究提供一些新的思路。     

人粪便宏基因组α-L-鼠李糖苷酶的酶学性质及其对芦丁的生物转化

HFM-rha78是本实验室从健康人体粪便宏基因组DNA中获得的新型细菌源α-L-鼠李糖苷酶基因。该基因全长2 166 bp，编码蛋白质分子质量为83 kD，等电点5.58，其二级结构以α螺旋和无规卷曲为主，整体表现出亲水性，其氨基酸序列与GenBank收录的序列一致性仅为48%。系统进化树表明，该酶被分类至亚家族Ⅱ，其催化广义酸和广义碱均为谷氨酸，催化残基高度保守。为明确其酶学性质，以对硝基苯酚-α-L-吡喃鼠李糖苷（p-nitrophenyl-α-L-rhamnopyranoside，pNPR）为底物，通过紫外 可见分光光度法测定产物对硝基苯酚的生成量，得到HFM-Rha78的最适反应温度为50℃，最适pH为6.5，且在30～46℃下保温30 min，不影响活力。为初步研究其对芦丁的水解能力，首先对HFM-Rha78的有机溶剂耐受性进行了研究。结果表明，该酶能普遍耐受1%的有机溶剂，甚至1%～ 5%的异丙醇和1%的β 巯基乙醇，有提高其活性的能力。当DMSO浓度为10%时，仍能保持79%的酶活性。HFM Rha78对底物pNPR的Vmax为129.9 μmol min-1 mg-1，HFM-Rha78的KM较大，为26.0 mmol L-1。转换数kcat为185.1 s-1，催化效率kcat/KM为7.1×103 s-1 mol-1 L。采用高效液相色谱仪检测HFM-Rha78水解芦丁的能力。结果表明，37℃条件下，随着酶浓度和水解时间增加，芦丁转化率增大。反应10 h时，芦丁转化率达41.8%。本研究获得了HFM-Rha78的最适反应条件，并确定其可特异性生物转化芦丁为异槲皮素。     

ERIC-PCR在人工混合菌体系中的检出灵敏度

提取大肠杆菌DHSα和阴沟肠杆菌(E-26R)的基因组DNA,进行ERIC-PCR,可以分别得到稳定而独特的DNA指纹图谱;模板量的变动范围从10～100ng都不会影响其图谱的稳定性;在图谱中DHSa和E-26R各自均有一条含量最大的特征带,其不易受实验环境和实验条件的干扰而发生变化。把DHSa和E-26R按比例混合,提取混合菌基因组DNA,进行ERIC-PCR,结果表明：混合菌的DNA指纹图谱为各纯菌图谱的叠加,亦具有稳定性;通过对凝胶电泳图谱中特征带的分析,可以看出：当DHSα的菌含量达到总菌量的0．5％时,可被ERIC-PCR方法清楚地检测出来。为ERIC-PCR用于土壤微生物和环境微生物的研究,特别是用于发酵工业中杂菌污染的检测与鉴定提供了一定的依据。     

番茄内生菌分离及其ERIC-PCR指纹图谱分析*

介绍了一种分离植物内生菌和研究其多样性的方法。用无菌水、化学试剂、紫外线和机械去表皮 4种方法对番茄植株进行处理 ,然后分别用牛肉膏蛋白胨、高氏一号和PDA(加链霉素抑制细菌生长 ) 3种培养基分离内生菌。确定了最适宜的去除非内生菌的方法。经分离、纯化得到 1 4 8株大小、形态、颜色各异的内生菌分离物。对其中 43株进行ERIC PCR扩增 ,32株有扩增条带的菌株可分为 2 8种。把纯化的菌株分别与番茄早疫病菌进行平板对峙培养。筛选出抑菌效果较好的 3株菌。     

日本血吸虫童虫细胞免疫小鼠抗血吸虫病 的免疫保护性研究

为确定用日本血吸虫(Schistosoma japonicum, S.j)童虫细胞免疫小鼠抗血吸虫病的免疫保护性效应和分析与之可能的相关因素, 本研究进行了两个独立重复的免疫实验. 经皮下3次免疫后, 实验1在无佐剂的情况下, 与磷酸盐绥冲液(PBS)对照组比, S.j童虫原代细胞(primary juvenile worm cells, pJCs)诱导小鼠产生了明显的减虫率(平均54.3%)、每克肝卵(liver eggs per gram, LEPG)减少率(平均59.8%)和肝卵肉芽肿面积减少率(平均66.5%)(P<0.01), 均明显高于童虫原代细胞碎片(fractions of juvenile worm cells, JCFs)或童虫虫体碎片(fractions of juvenile worms, JWFs)免疫组相应的减少率(P<0.05), 而虫体的非细胞成分(non-cell components of worms, WNCs)免疫组无明显保护作用. 实验2中, 与PBS对照组比, 培养的童虫细胞(cultured juvenile worm cells, cJCs)也诱导了明显的平均58.4%的减虫率、68.1%的LEPG减少率(P<0.01), 而培养的成虫细胞(cultured adult worms cells, cACs)组的虫荷(P<0.05)和卵荷(P<0.01)明显高于cJCs组. 实验2的免疫学分析显示, cJCs诱导小鼠产生Th1型为主的Th1/Th2混合类型的免疫应答, 而cACs则诱导Th2型偏向的应答类型. 这些资料显示, 用S.j原代和培养的童虫细胞都可诱导小鼠产生明显的抗血吸虫高保护效应, 可能与免疫原的物理性状、虫期特异性及诱导的免疫类型有关, 提示用S.j童虫全细胞免疫小鼠是一种有希望的诱导抗血吸虫病保护性免疫的方法.     

产过敏素harpin的固氮工程菌的某些特性研究*

研究了产过敏素harpin的固氮工程菌(Enterobacter cloacae E4)在番茄、烟草叶片上的致过敏能力及该菌所携的双质粒的稳定性。试验结果表明:E4与DH5(pCPP430)致过敏能力的速度和强度基本相同。E4与308R(pCPP430)相比,烟草上它们致过敏能力的速度基本一致,但308R(pCPP430)致过敏能力的强度更强,在番茄叶片上,E4和308R(pCPP430)致过敏能力的速度和强度基本一样。E4所携的双质粒pCPP430和pMC73A在宿主细菌中是不稳定的,在宿