模拟人体胃肠道环境筛选益生乳杆菌

【目的】筛选具有益生特性的乳杆菌作为保健型酸奶的候选菌株。【方法】从健康人肠道和奶豆腐中分离筛选出耐受人工胃液的乳杆菌,对其进行体外益生特性(人工胃肠液耐受性、胆盐耐受性、抑菌活性及胆固醇降解能力)研究。【结果】从在乳杆菌分离培养基上有溶钙圈的41株菌株中筛选出5株耐酸、耐人工胃液较强的菌株,经16S rR NA基因测序鉴定,其中3株为乳杆菌,分别命名为植物乳杆菌Lp MT-3、植物乳杆菌Lp MT-5和唾液乳杆菌LsA F-7。在人工胃液中3株菌的耐受力均强于商品化的对照菌株LGG(鼠李糖乳杆菌GG);转入肠液4 h后直至26 h,Lp MT-5存活率基本稳定在45%左右,仅次于LGG。胆盐浓度为0.10%时,3株乳杆菌的耐胆盐能力均强于LGG;胆盐浓度为0.20%时,Lp MT-3和LsA F-7仍能存活。3株乳杆菌均具有抑菌活性,对粪肠球菌的抑制最明显,其次是金黄色葡萄球菌,对大肠杆菌、沙门氏菌的抑制作用较差。3株乳杆菌对胆固醇的清除效力依次为Lp MT-3LpM T-5Ls AF-7;清除率依次为Ls AF-7Lp MT-3LpM T-5。【结论】筛选出3株适应人体胃肠液环境、耐胆盐、抑菌及降胆固醇活力强的乳杆菌,可作为进一步开发新的益生菌产品和保健型酸奶的菌株。     

荞麦中光毒物质的转化及荞麦光敏素对人结肠癌细胞HCT-116的抑制活性

荞麦光敏素（fagopyrins）具有光毒性和酪氨酸激酶抑制活性,可作为光动力治疗中的光敏剂,用于癌症的治疗。本研究采用电喷雾质谱法和荧光光度法,探究了荞麦中光毒物存在的型式,并分析了光敏素前体(protofagopyrin)转化为荞麦光敏素的条件。通过MTT细胞实验,研究荞麦光敏素提取物对人结直肠癌细胞和人结肠上皮细胞生长增殖的影响。结果表明,荞麦中光毒物以光敏素前体为主,并且有微量的荞麦光敏素,前者质谱的离子强度是后者的400倍。光敏素前体的转化发生在光照提取过程中,而且提取液在光照放置过程中,光敏素前体继续转化,尤其是前0.5 h对于转化的影响显著超过了提取过程。荞麦光敏素提取物与细胞作用,避光培养时,对HCT-116癌细胞有轻度的抑制作用;而对FHC正常细胞不仅未见抑制还有促进作用。光照结合避光培养时,荞麦光敏素对癌细胞的抑制随着提取物浓度的增加而增强,当提取物浓度达到200 μg/mL时,抑制率达到50%;而对正常细胞提取物,浓度低于200 μg/mL时未见抑制,500 ～ 1 000 μg/mL时抑制率达到50%。光敏素提取物与金丝桃素抑制细胞的能力相比,光照结合避光培养时,金丝桃素对正常细胞的抑制作用强于对癌细胞,而荞麦光敏素的提取物正好相反。提示荞麦光敏素比金丝桃素对癌细胞的抑制更具特异性。上述结果为从荞麦叶中开发出有利于肿瘤治疗的药物提供了实验依据。     

人粪便宏基因组α-L-鼠李糖苷酶的酶学性质及其对芦丁的生物转化

HFM-rha78是本实验室从健康人体粪便宏基因组DNA中获得的新型细菌源α-L-鼠李糖苷酶基因。该基因全长2 166 bp，编码蛋白质分子质量为83 kD，等电点5.58，其二级结构以α螺旋和无规卷曲为主，整体表现出亲水性，其氨基酸序列与GenBank收录的序列一致性仅为48%。系统进化树表明，该酶被分类至亚家族Ⅱ，其催化广义酸和广义碱均为谷氨酸，催化残基高度保守。为明确其酶学性质，以对硝基苯酚-α-L-吡喃鼠李糖苷（p-nitrophenyl-α-L-rhamnopyranoside，pNPR）为底物，通过紫外 可见分光光度法测定产物对硝基苯酚的生成量，得到HFM-Rha78的最适反应温度为50℃，最适pH为6.5，且在30～46℃下保温30 min，不影响活力。为初步研究其对芦丁的水解能力，首先对HFM-Rha78的有机溶剂耐受性进行了研究。结果表明，该酶能普遍耐受1%的有机溶剂，甚至1%～ 5%的异丙醇和1%的β 巯基乙醇，有提高其活性的能力。当DMSO浓度为10%时，仍能保持79%的酶活性。HFM Rha78对底物pNPR的Vmax为129.9 μmol min-1 mg-1，HFM-Rha78的KM较大，为26.0 mmol L-1。转换数kcat为185.1 s-1，催化效率kcat/KM为7.1×103 s-1 mol-1 L。采用高效液相色谱仪检测HFM-Rha78水解芦丁的能力。结果表明，37℃条件下，随着酶浓度和水解时间增加，芦丁转化率增大。反应10 h时，芦丁转化率达41.8%。本研究获得了HFM-Rha78的最适反应条件，并确定其可特异性生物转化芦丁为异槲皮素。