miR-455慢病毒表达载体的构建与鉴定

目的：构建人源microRNA-455（miR-455）慢病毒载体,并鉴定成熟has-miR-455在细胞内的表达水平。方法：提取siHa细胞中的人基因组DNA,设计并合成人miR-455的上下游引物,PCR扩增目的基因,将其中表达miR-455的结构经酶切后插入慢病毒转移质粒pWPT-GFP,构建成pWPT-GFP-pri-miR-455,在293T细胞中与pMD2G、pSPAX2包装产生慢病毒,并用含慢病毒的上清感染SiHa细胞。结果：测序结果证明插入质粒载体中的miR-455前体序列完全正确,慢病毒载体构建成功并获得相应的慢病毒;重组慢病毒质粒pWPT-GFP-pri-miR-455感染SiHa细胞后上调miR-455的表达近40倍。结论：构建了miR-455的慢病毒载体,并能在293T细胞中表达,产生的慢病毒能成功感染SiHa细胞。为进一步研究miR-455的功能,以及利用慢病毒进行基因治疗奠定了基础。     

独活水提部位化学成分的HPLC-ESI-Q-TOF-MS分析

本文通过HPLC-ESI-Q-TOF-MS技术对独活水提取部分中的化学成分进行定性分析,采用LC-MS/MS,C18色谱柱(4.6 mm×250 mm,5μm),以甲醇-0.1%甲酸溶液为流动相梯度洗脱,使用ESI离子源,正离子与负离子模式下采集数据。通过正、负离子质谱信息及元素组成,分析与相关文献数据对照,共鉴定出12个化合物,为阐明独活水提部分的药效物质基础提供有力的证据。     

LRP16短发夹RNA慢病毒载体的构建及LRP16稳定抑制细胞的建立简

目的：构建靶向LRPl6基因的短发夹RNA（shRNA）慢病毒表达载体,鉴定其在HeLa细胞中对LRP16的抑制效果。方法：构建pWPT-U6-LRPl6shRNA-CMV-GFP慢病毒载体,通过病毒感染、细胞筛选、Western印迹等步骤,获得LRP16基因稳定抑制的细胞株。结果：构建了具有LRP16干扰效果的慢病毒载体,感染HeLa细胞后获得了稳定沉默LRP16及对照的细胞株;经克隆筛选,在荧光显微镜下观察到近似100％感染细胞发出绿色荧光;Western印迹证实pWPT-U6-L374-CMV-GFP和pWPT-U6-L668-CMV-GFP均可显著抑制HeLa细胞株中LRP16蛋白的表达,其中pWPT-Gsi-L374-GFP的抑制效果更好。结论：构建了靶向人LRP16基因shRNA慢病毒载体及LRP16稳定抑制的HeLa细胞系。     

具核梭杆菌协同Cdk5促进结直肠癌细胞迁移

目的以结直肠癌细胞SW480作为研究载体,分析具核梭杆菌(F.nucleatum)对Cdk5和STAT3途径相关基因及其炎症因子表达的影响,阐明F.nucleatum协同Cdk5促进结直肠癌形成和发展的分子机制。方法以结直肠癌细胞SW480作为研究载体,运用Western Blotting、qPCR、免疫组化和细胞划痕等实验研究F.nucleatum和Cdk5对结直肠癌形成的影响。结果免疫组化结果显示,癌组织Cdk5阳性表达率明显高于癌旁组织(t=8.218,P0.01)。细胞划痕实验结果表明,F.nucleatum菌液作用的结直肠癌细胞迁移率明显高于对照组(24 h:t=5.868,P0.01; 48 h:t=6.941,P0.01)。Western Blotting结果显示,F.nucleatum协同Cdk5可能通过STAT3通路调控结直肠癌细胞凋亡。qPCR结果显示,F.nucleatum菌液作用的结直肠癌细胞的炎症因子表达明显高于对照组(IL-6:t=5.542,P0.05; COX2:t=16.893,P0.01; TNF-α:t=16.963,P0.01; IL-8:t=3.733,P0.01)。结论 F.nucleatum协同Cdk5促进了结直肠癌细胞的迁移。     

北细辛超临界萃取物挥发性成分的GC-MS分析

采用超临界流体萃取法(SFE)和水蒸气蒸馏法分别对北细辛根及根茎进行提取分离,分别得5.5%SFE萃取物和2.8%挥发油。应用GC-MS分析,从北细辛SFE萃取物中鉴定出7种化学成分,占萃取物总量的72.70%,其中甲基丁香酚为44.62%;从细辛挥发油中鉴定出19种化学成分,占挥发油总量的88.53%,其中甲基丁香酚为43.02%。两种方法有6种成分完全相同,其中致癌物质黄樟油素SFE法比蒸馏法低2.8倍。北细辛根及根茎超临界萃取物与水蒸汽蒸馏挥发油主要成分相同,但其化学组成存在较大差异,提示药效亦不相同。超临界流体萃取法是剂型改革的有效方法之一。     

珍稀药用植物明党参呋喃香豆素成分累积分布研究

采用HPLC法测定明党参不同器官、不同生长期中珊瑚菜内酯、5-羟基-8-甲氧基补骨脂索的含量.结果表明,明党参根、茎叶、花葶及果实均含有2种呋喃香豆索,2种呋喃香豆素总量,根中以6月为最高,为163.8467 pg/g;茎叶以1月为最高,为606.1023μg/g;花葶以6月上旬(生长发育接近成熟时)为最高,为117.1185μg/g;果实以成熟期为最高,达1070.6326μg/g.提示明党参药用器官(根)和非药用器官(茎叶、花葶、果实)为天然呋喃香豆索优质药用植物资源,具有广泛开发利用的前景.     

一种安全高效大豆转化筛选体系的建立

以灭草烟作为筛选剂,利用基因枪法建立一种安全高效的大豆遗传转化体系.比较不同筛选剂对大豆胚尖外植体丛生芽诱导数目的影响.与卡那霉素、潮霉素和草胺膦等传统筛选剂相比,以灭草烟作为筛选剂可使丛生芽的数目增加1倍以上.克隆了拟南芥突变体csrl-2中突变的乙酰羟基酸合成酶基因(ahas),以其作为筛选标记基因,构建可利用灭草烟作为筛选剂的植物表达载体.利用基因枪法将该载体转化大豆,获得6棵灭草烟抗性植株,分子检测证明外源ahas基因整合到5棵转基因大豆植株的基因组中.     

GL-7ACA酰化酶表达检测系统的建立

戊二酰－7－氨基头孢烷酸（GL－7ACA）酰化酶能够催化GL－7ACA分解生成7－ACA,后者是工业半合成生产头孢类抗菌素所需的重要前体。为了准确地检测GL－7ACA酰化酶及其突变体的表达,本研究通过构建一系列质粒载体,建立了两个简便有效地测定GL－7ACA酰化酶基因acy表达量的系统,从而可对酶的比活力进行定量。我们将两个报告基因,即儿茶酚双加氧酶基因（xylE)和β－半乳糖苷酶基因（lacZ)分别置于acy基因的下游,使之与acy基因共用一个启动子,进行串联表达,各自构成一个多顺反子系统。实验证明,基因融合后的儿茶酚双加氧酶或β－半乳糖苷酶的活力可以间接反映acy的表达量。     

中国特有植物明党参化学成分和药理研究进展

本文报道中国特有名贵中药明党参ＣｈａｎｇｉｕｍｓｍｙｒｎｉｏｉｄｅｓＷｏｌｆ根的化学成分与药理研究的最新进展及应用历史概况,阐明了该药物治病物质基础,发现了新的活性成分和药效,提出了合理、科学、先进的质量检测指标和方法。为开发防治老年病的新药提供了实验基础。对明党参道地性研究亦具有重要意义。