过表达purA基因对腺苷积累的影响

利用穿梭质粒pBE43,在腺苷产生菌枯草芽孢杆菌Bacillus subtilis XGL (Xan^-+ Deam^-+8-AG^r+SG^r)中过表达腺苷生物合成途径中关键酶腺苷酸琥珀酸合成酶(ADSS)的基因purA,研究其对腺苷积累的影响。以腺苷产生菌XGL基因组为模板,扩增出purA基因,将其连接到穿梭载体pBE43上,获得重组质粒pBE43∷purA。将重组质粒转化入XGL中,构建新的产生菌XGL-SY。通过逆转录PCR和定量PCR测定purA基因在腺苷产生菌XGL和XGL-SY中的转录量,并利用5 L罐发酵实验测定发酵参数的变化。分析发酵对数期的基因转录发现,在添加质粒后,purA基因的转录量提高了约9倍。上罐实验表明改造后的产生菌XGL-SY,菌体生长虽然受到一定的影响,但在相同发酵周期内腺苷产量提高了10.8%。研究结果表明在腺苷产生菌中过表达purA基因可以促进腺苷的积累,这为腺苷工程菌的进一步改造奠定了基础。     

谷氨酸棒杆菌YILW苏氨酸脱水酶基因的克隆表达及酶学性质

将L-异亮氨酸生产菌谷氨酸棒杆菌(Corynebacterium glutamicum YILW)苏氨酸脱水酶(threonine de-hydratase,TD)的编码基因ilvA在大肠杆菌中进行异源表达及进行初步的酶学性质研究。分别以C.glutamicum ATCC13032、YILW的基因组DNA为模板,利用PCR技术扩增出苏氨酸脱水酶的编码基因ilvA,测序获得编码序列。利用质粒PET-His将该基因在大肠杆菌BL21(DE3)中进行重组表达、金属螯合纯化,对其酶学性质进行初步研究。结果显示C.glutamicum YILW编码基因序列与已报道的ilvA序列相差5个碱基,相似度为99.6%,第383位氨基酸由苯丙氨酸突变为缬氨酸。酶学性质研究表明:重组酶YilwTD最适反应温度为32℃,在20~55℃范围内该酶较稳定,最适pH为6.7,该酶底物专一性强,对最适底物苏氨酸的米氏常数Km=8.32 mmol/L,最大反应速度Vmax=3.18×104U/mg,与野生型酶相比,突变(F383V)后可显著降低终产物对酶的反馈抑制作用。为揭示突变对苏氨酸脱水酶活性的影响及进一步利用基因工程技术改造L-异亮氨酸生产菌,提高L-异亮氨酸产量奠定了基础。     

枯草芽孢杆菌产胞苷的初步研究

目的:通过对野生型枯草芽孢杆菌NO122的诱变筛选,选育出胞苷产生菌株。方法:以野生型枯草芽孢杆菌为出发菌株进行紫外线、硫酸二乙酯诱变,经3-脱杂氮尿嘧啶、5-氟胞苷结构类似物平板定向筛选产胞苷突变株;研究碳源、氮源、温度、初始pH值等发酵条件对该突变菌株产胞苷的影响。结果:经诱变传代后得到突变株TZM1012,该突变株在发酵温度37℃、初始pH7.2、摇床转速220r/min的条件下,摇瓶发酵72h,发酵液中的胞苷可达1.873g/L,并具有较好的遗传稳定性。结论:获得产胞苷生产菌株,并具有较好的遗传稳定性。     

营养及环境因素对黄色短杆菌发酵生产L-亮氨酸的影响

目的:研究葡萄糖、玉米浆、蛋氨酸等主要营养物质以及环境因素对发酵生产L-亮氨酸的影响。方法:应用单因素实验确定发酵条件,采用高效液相色谱法测定产量。结果:在最优发酵条件下,以种龄36h、接种量为10%,摇瓶产L-亮氨酸的量可达19.4g/L,采用10L罐分批补料发酵64h可积累29.47g/L的亮氨酸。结论:营养及环境因素对发酵生产L-亮氨酸具有重要影响。     

苏云金芽孢杆菌重组L-异亮氨酸羟化酶的酶学性质及其在4-羟基异亮氨酸合成中的应用

【目的】克隆并表达来源于苏云金芽孢杆菌(Bacillus thuringiensis)TCCC 11826的L-异亮氨酸羟化酶(L-isoleucine-4-hydroxylase,IDO),测定重组IDO酶学特性并构建用于4-羟基异亮氨酸(4-Hydroxyisoleucine,4-HIL)微生物转化的重组菌株,以考察该酶在4-HIL合成中的潜在应用价值。【方法】以B.thuringiensis TCCC 11826基因组为模板PCR扩增ido基因并构建该基因过表达菌株BL-IDO;采用Ni-NTA亲和层析法分离纯化重组IDO后检测其酶学特性;构建重组株菌W3110-IDO进行4-HIL的微生物转化。【结果】克隆B.thuringiensis TCCC 11826的ido基因,测序结果显示该基因含723个核苷酸,编码240个氨基酸,与已报道的B.thuringiensis 2-e-2的ido基因相似度分别为97.47%和97.91%。此IDO含有His1-X-Asp/Glu-Xn-His2基序,属于Fe2+和α-酮戊二酸依赖型羟化酶家族;酶学实验表明该酶能够特异性地催化L-异亮氨酸生成(2S,3R,4S)-4-HIL,其Km和Vm ax分别为0.18 mmol/L和2.10μmol/min/mg,最适反应温度和pH分别为35℃和7.0,该酶于35℃条件下放置5 h后仍具有85.1%的活性;在Escherichia coli W3110中过表达重组IDO,在未经优化条件下4-HIL最高转化率达89.28%。【结论】获得IDO编码基因序列(Accession No.KC884243)并首次较为系统地研究了其酶学特性,该酶反应条件温和且具有较高的活性及稳定性,在酶法或微生物转化法合成4-HIL中有较广泛的应用价值。本研究可为4-HIL及其它氨基酸衍生物的生物制造技术奠定理论基础。     

基于代谢计量分析的L-苏氨酸发酵过程优化

目的:以L-苏氨酸生产菌株TRFC为供试菌株,基于代谢计量分析对发酵过程中底物葡萄糖、蔗糖的影响做理论分析并对发酵过程进行优化.方法:利用代谢计量学方法对L-苏氨酸生产菌株代谢途径进行分析,以碳源优化及5、10 L发酵实验进行过程优化.结果与结论:发酵过程中,生物量及苏氨酸的产率取决于由葡萄糖转化的生物量占总量的摩尔比率,及转化的苏氨酸占总量的摩尔比率,最大理论值分别为24.1%、17.89%;种子及发酵培养基中葡萄糖与蔗糖的添加比例分别为2:8、8:2时得到最优值,L-苏氨酸最终产量为70 g/L.     

硫酸软骨素研究现状

硫酸软骨素是从动物软骨中提取的黏性多糖,在医药、化妆品和食品工业上有广泛的用途,市场前景广阔。本对硫酸软骨素的性质和用途做了简要的介绍,并阐述了近几年硫酸软骨素生产工艺的发展状况。     

枯草芽孢杆菌嘌呤合成途径的修饰对腺苷积累的影响

【目的】研究嘌呤操纵子中purF、purM、purN、purH和purD基因的共同过表达对枯草芽孢杆菌发酵生产腺苷的影响。【方法】利用温敏质粒pKS1,以单交换的形式增加了purF基因在基因组上的拷贝数,同时将强启动子P43插入嘌呤操纵子中,使嘌呤合成途径中purF基因及其下游purM、purN、purH和purD基因的表达水平得到加强,通过实时定量PCR(Realtime Quantitative PCR,RT-qPCR)测定相关基因(purF、purM、purN、purH和purD)的转录水平;通过酶活性检测分析关键酶基因扩增对PRPP转酰胺酶活性的影响;通过发酵实验考察出发菌株与工程菌株的生长、耗糖和腺苷积累情况。【结果】实时定量PCR结果表明,purF、purM、purN、purH和purD基因的表达水平均有不同程度的提高,嘌呤合成途径中关键酶PRPP转酰胺酶的活性是出发菌株的2.4倍。摇瓶发酵实验发现工程菌腺苷产量较出发菌提高17.5%,糖苷转化率增加26.1%。5 L罐发酵实验表明,虽然工程菌的菌体生长受到一定的影响,但在相同发酵周期内腺苷产量比出发菌提高了9.7%。【结论】嘌呤操纵子中purF、purM、purN、purH和purD基因转录水平的增强能够提高腺苷的产量,为通过代谢工程技术改造腺苷生产菌提供了理论依据和研究思路。     

黄色短杆菌GDK-9谷氨酸脱氢酶基因的克隆、序列分析及表达

利用PCR技术从黄色短杆菌GDK-9的基因组DNA中扩增出谷氨酸脱氢酶基因(gdh)片段(EC.1.4.1.4), 连到pUCm-T载体上测序。核酸序列分析结果表明, 该片段全长1927 bp, 包含一个ORF, 推测此ORF区编码一条448个氨基酸的多肽, 分子量约为48 kD。与已报道的gdh序列相似性为99.55%, 其中1190位碱基(C→A)突变导致了编码氨基酸的变化(Thr→Asn), 其它的碱基变化不影响编码的氨基酸。将gdh基因克隆入穿梭质粒pXMJ19中, 并转化E. coli XL-Blue和Brevibacterium flavum GDK-9, 经IPTG诱导后, SDS-PAGE电泳结果显示, 在预计位置出现明显的诱导蛋白条带, 分子量约为48.7 kD。谷氨酸发酵实验表明, 尽管谷氨酸脱氢酶GDH能明显提高胞内的谷氨酸含量, 但其不影响谷氨酸的分泌。     

特定营养物对L-谷氨酸发酵的影响及优化

目的：以黄色短杆菌GDK-9为供试菌株,分析柠檬酸钠、菌体水解液和产酸促进剂等特定营养物的添加对L-谷氨酸发酵的影响,并对其发酵条件进行优化研究。方法：在单因子实验确定添加时间的基础上,应用SAS软件中的响应面分析方法（RSM）对柠檬酸钠、菌体水解液和产酸促进剂等3个因素的添加量进行优化;采用多元二次回归方程拟合3种因素与L-谷氨酸产量的函数关系,并得到其最适添加量。结果与结论：当柠檬酸钠、菌体水解液和产酸促进剂的添加量分别为0.355%、0.297%和0.183%时,10L自控罐发酵产谷氨酸达到140g/L,比优化前（128g/L）提高了9.38%。