甜荞胰蛋白酶抑制剂cDNA片段的克隆及序列特征

采用盐析、凝胶过滤和离子交换层析等方法从甜荞中纯化出荞麦胰蛋白酶抑制剂(buckwheat trypsm inhibitor,BTI),经活性鉴定该抑制剂属丝氨酸类蛋白酶抑制剂家族。为了获得BTI的基因序列,并弄清其在体内的表达调控机制,应用RTPCR和3’-RACE等方法,直接体外扩增该抑制剂基因,首次获得总长为361bp的DNA片段(GenBank登录号为AY335158),并命名为BTI-W1。该片段包括一个183bp的开放阅读框,编码61个氨基酸。由该基因推导的氨基酸序列与已报道的荞麦胰蛋白酶抑制剂BTI-2的氨基酸序列的同源性达100％。BTI-WI基因的获得,对于深入开展荞麦胰蛋白酶抑制剂结构与功能关系的研究具有重要意义,也为荞麦植物资源的开发利用建立了前期研究基础。     

固态发酵下酵母自溶的工艺优化

固态下酵母自溶可以有效促进菌体内多种活性物质的释放,进而提高酵母类产品的品质。通过优化自溶温度、自溶时间及自溶促进剂锌离子浓度以获得固态发酵下酵母自溶的最佳工艺,对固态发酵物料中游离氨基酸、可溶性蛋白、α-氨基氮含量和A260/A280等指标的分析来确定固态酵母自溶工艺条件,在此基础上以自溶温度40 ℃、50 ℃、55 ℃;作用时间12、18、24 h;锌离子添加浓度2、4、8 mg/kg设置L9(33)正交试验,进一步优化固态酵母自溶的工艺参数。结果表明酵母自溶的最佳工艺条件为：自溶温度55 ℃、作用时间18 h、锌离子浓度2 mg/kg,此时其可溶性蛋白含量可达9.31 mg/g、游离氨基酸14.36 mg/g、α-氨基氮10.16 μg/g、A260/A280为1.73。经工艺优化后,可显著提高酵母自溶产物可溶性蛋白、游离氨基酸和α-氨基氮的含量,从而明显提高了复合菌培养物的品质。     

增温和隔离降雨对亚热带森林土壤N2O通量的影响

设置对照(CT)、增温5 ℃(W)、隔离50%降雨(P)和增温5 ℃+隔离50%降雨(WP)4种处理,以相关功能基因作为标志物,研究增温和隔离降雨影响亚热带森林生态系统土壤N₂O通量变化的途径.结果表明: 隔离降雨显著降低了土壤铵态氮浓度;增温显著降低了土壤N₂O通量和土壤反硝化势.增温处理(W)和降雨处理(P)的土壤微生物生物量氮(MBN)均显著低于对照(CT),AOA amoA基因丰度与MBN和铵态氮含量之间呈显著负相关,但与土壤硝化势和土壤N₂O通量没有显著相关性.路径分析显示,反硝化势直接显著影响土壤N₂O通量,而微生物生物量磷(MBP)和增温则通过直接影响反硝化势来间接影响土壤N₂O通量.温度可能是影响亚热带森林土壤N₂O通量的主要驱动因素,全球变暖可能会减少亚热带森林土壤的N₂O排放.     

探讨翻转课堂在检验医学教育中的应用

翻转课堂(ICM,inverted classroom model)是在多媒体快速发展的基础上建立起来的一种融合多种学习方法的混合性教学方法。在课堂之前,借助网络、微课、期刊等多种途径制作辅助材料,并让学生通过使用这些材料接触和自学教学内容包含的基础知识;课堂中通过师生互动,积极提出疑问、剖析讨论、探究解决问题;课后通过各种测试反馈学生在本次课程中的表现,同时对教学活动进行评价。成功的翻转课堂应具有以下几个目标:(1)提高学生学习主观能动性,快速掌握基础知识;(2)学生和教师充分互动交流;(3)刺激学生更深入掌握辅助资料中的知识;(4)培养学生的批判性思维;(5)提高学生分析、综合以及评价等能力。我国医学教育结构复杂,各个领域相互关联,单一的教学模式不能满足当前的教学要求。电子产品、电子书籍、期刊、小视频普遍使用,以及大量公开的教育资源为翻转课堂的教学模式完善提供更多的途径,如何更有效的应用翻转课堂是各专家们关注的焦点。     

北京地区传播的SARS冠状病毒N区基因变异分析

SARS冠状病毒的N蛋白具有很强的免疫原性 ,是机体产生特异性体液反应主要针对的靶分子之一。收集并提取了我院收治的北京地区 1 2位确诊SARS患者的病毒RNA样本 ,用反转录巢式聚合酶链式反应分 3个片段扩增出N基因全序列 ,用pGEM T载体克隆后进行DNA序列分析。结果发现 ,在 1 2条病毒N基因序列中 ,与北京地区最早报告的BJ0 1株SARS冠状病毒N基因序列相比 ,有 3个核苷酸替换 ,分布于 2个序列位点 ,分别为 2 841 7G→C(aa1 0 6S→T)和 2 8433C→T(aa1 1 1F→F同义突变 ) ,均为新发现的变异位点。结果表明 ,北京地区传播的SARS冠状病毒N基因存在变异序列 ,但发生频率较低 ,提示N基因的结构稳定对病毒的生存较为重要。     

一种苦荞主要过敏原基因cDNA的克隆及序列分析

为了获得苦荞中主要过敏原的cDNA和由此推导的蛋白质序列 ,分析其结构特点 ,以苦荞幼根根尖为材料 ,提取总RNA并反转录mRNA为cDNA第一链 .通过RT PCR、3′RACE、基因克隆及序列测定 ,获得一种苦荞主要过敏蛋白基因的cDNA片段 (GenBank登录号为AY0 4 4918) .该cDNA片段由 76 8bp组成 ,包括 3′端非编码区 180个bp ,开放阅读框 5 88bp .可编码一个由 195个氨基酸残基组成的功能蛋白及一个终止密码 .苦荞主要过敏原基因与甜荞 2 2kD过敏蛋白、豆球类蛋白的核苷酸序列分别有 95 %和 93%的同源性 .其推导的氨基酸序列与甜荞球蛋白、刀豆蛋白、甜橙柠檬素分别有 93%、83%和 5 7%的同源性 .该过敏蛋白 183～ 188位氨基酸残基KEEEKE在多数不同过敏原中均存在 ,推测可能为其中的抗原决定簇序列     

重组苦荞麦过敏蛋白TBa的原核表达及其免疫活性鉴定

TBa ［tartary buckwheat allergen］是苦荞麦中的一种主要过敏蛋白.根据长度为585 bp 的TBacDNA序列,以pET-28a为表达载体并选择合适的酶切位点合成上、下游引物,采用基因克隆技术构建重组表达载体pET-28a-TBa.进一步将重组质粒转入大肠杆菌BL21(DE3) 中进行表达.从而获得以包涵体形式存在的TBa目的蛋白.该目的蛋白经Ni ²⁺ -NTA琼脂糖柱亲和纯化及SDS-PAGE分析显示, 纯度达到95% 以上.用透析复性的方法将目的蛋白重折叠,其复性产率可达到约68%.Western印迹证实,目的蛋白N端带有6个组氨酸标签.ELISA检测表明,通过基因重组及表达获得的重组苦荞麦过敏蛋白,与天然苦荞种子中的该蛋白具有相似的免疫学活性,与荞麦过敏病人血清中的IgE有特异性的结合.     

一种苦荞麦种子蛋白酶抑制剂的纯化、特性及其抗虫活性

蛋白酶抑制剂广泛存在于生物体内, 是自然界含量最为丰富且具有一定防御作用的蛋白种类之一. 本文采用离子交换层析和凝胶层析等方法,从苦荞麦种子中分离出一种胰蛋白酶抑制剂（TBTI-Ⅱ）. SDS-PAGE分析表明,TBTI Ⅱ的分子量约9.0 kD,由80个氨基酸残基组成,分子中含有较多的 Glu, Asp 和Arg. TBTI-Ⅱ具有较高热稳定性.当在100℃加热处理10 min后,仍保留有67.6%的抑制剂活性. 动力学测定显示,来自苦荞麦中的TBTI-Ⅱ对胰蛋白酶的抑制作用常数(Ki)为1.01×10－4 mol/L. 另外,将含有不同活力单位的苦荞麦蛋白酶抑制剂掺入到棉铃虫的饲料中进行饲养试验显示,TBTI-Ⅱ具有明显的抑制棉铃虫生长的作用. 这些结果表明,来自苦荞麦种子中的小分子蛋白酶抑制剂可能是一种潜在的抗虫因子.     

DOM对米槠次生林不同土层土壤微生物呼吸及其熵值的影响

可溶性有机质(Dissolved organic matter,DOM)作为土壤可溶性有机碳的重要来源,进入土壤之后通过改变土壤微生物数量和活性影响土壤矿化。DOM输入对土壤微生物呼吸和熵值的研究多集中在表层土壤,但对深层土壤微生物呼吸和熵值的影响关注较少。通过室内培养实验(120 d)研究米槠(Castanopsis carlesii)鲜叶DOM添加对表层土壤(0—10 cm)和深层土壤(40—60 cm)微生物呼吸及其土壤代谢熵和微生物熵的影响,为揭示DOM输入对亚热带森林土壤碳过程的影响提供理论依据。结果表明,在培养第1天,添加DOM的表层和深层土壤CO_2瞬时排放速率均显著高于对照(P0.001),分别是对照(不添加DOM)的3.58倍和6.93倍,之后显著下降。就累积排放量而言,无论是DOM添加处理还是对照,表层土壤显著大于深层土壤;在米槠鲜叶DOM添加后,表层土壤累积排放量显著大于对照的表层土壤(P0.001),但DOM添加处理深层土壤累积排放量与对照的深层土壤无明显差异。就微生物生物量碳而言,表层土壤微生物生物量碳含量在培养期间显著大于深层土壤。在整个添加DOM培养期间,表层土壤微生物生物量碳含量显著大于表层对照土壤,深层土壤微生物生物量碳含量显著大于深层对照土壤(第3天除外)。培养结束时(120 d),米槠鲜叶DOM添加处理下,表层土壤和深层土壤有机碳含量与第3天相比分别减少26%和19%。米槠鲜叶DOM添加处理后的深层土壤代谢熵(qCO_2)显著低于对照的深层土壤和DOM添加处理的表层土壤qCO_2(P0.001),说明外源DOM进入深层土壤后提高了土壤微生物对碳的利用效率。米槠鲜叶DOM添加处理后的深层土壤微生物熵是培养第3天的1.58倍,显著大于培养初期(P0.05),而DOM添加处理的表层土壤、对照的表层土壤与深层土壤的微生物熵分别是培养第3天的68%、79%和21%,说明DOM添加提高了深层土壤质量。     

Nlrp3 siRNA对高糖培养的肾小球系膜细胞促炎因子表达的影响及机制

该文研究了Nlrp3 siRNA对高糖培养的小鼠肾小球系膜细胞促炎因子表达水平的影响及相关机制。采用合成Nlrp3 siRNA转染高糖培养的系膜细胞(高糖组)和正常培养的系膜细胞(正常组)。运用实时荧光定量PCR和Western blot检测沉默Nlrp3后促炎因子IL-1β和TNF-α表达水平。运用生物信息学分析和Ch IP检测Nlrp3与炎症相关因子NF-κB的关系。运用Western blot检测了沉默Nlrp3后NF-κB的表达情况以及特异性抑制NF-κB后对Nlrp3的影响。结果表明,Nlrp3表达水平在高糖培养的系膜细胞中较正常组增高,将筛选出的沉默效应最优Nlrp3 siRNA转染入高糖培养的系膜细胞后,促炎因子IL-1β和TNF-α表达降低。进一步生物信息学分析和Ch IP实验结果显示,Nlrp3启动子区域与NF-κB亚单位p50具有靶向结合关系,同时,Western blot结果显示,在高糖系膜细胞中沉默Nlrp3后NF-κB p50表达减少,特异性抑制p50后Nlrp3同步降低,提示NF-κB是Nlrp3影响系膜细胞炎症因子表达的重要因素。因此,Nlrp3可能是调控高糖系膜细胞炎症反应的一个重要新因子,其机制可能是Nlrp3启动子与NF-κB结合,活化NF-κB,从而影响促炎因子表达。在糖尿病肾病中靶向调控Nlrp3可能为预防和治疗疾病提供一个新的方向。