我国H7N2亚型禽流感病毒CK/HB/1/02株分离鉴定

从鸡组织中获得了一株分离物,能凝集鸡红细胞,经负染后电镜观察可见球形、外被囊膜的病毒颗粒,直径约 90～100nm;经血凝抑制和神经氨酸酶抑制试验鉴定为H7N2亚型禽流感病毒(Avian influenza virus,AIV),命名 为A／Chicken／Hebei／1／2002(H7N2)(简称CK／HB／1／02)。将该病毒接种SPF鸡,测得静脉接种致病指数(IVPI) 为0．00,剖检可见实验鸡多种组织器官有出血性变化,判为低致病力AIV;接种后7d从实验鸡泄殖腔棉拭中回收 到病毒,并在血清中检测到H7亚型AIV抗体。经RT-PCR扩增了病毒HA1基因片段(约1．1kb),测定其核苷酸 序列并与GenBank中的序列比较。结果表明,该病毒的HA1基因序列与AIV标准株A／Afri．Star．／Eng-Q／79 (H7N1)的HA1基因同源性最高,为99．4％;与以色列和意大利H7N2 AIV的同源性较高,为96．8％～98．2％;与 美国H7N2病毒的同源性很低,约为81．0％;其HA裂解位点的氨基酸序列为-KGR-GLF-,符合低致病力AIV的 特征。     

利用绿色荧光蛋白基因gfp研究芽胞杆菌的启动子活性

利用绿色荧光蛋白基因gfpmut3,分别标记苏云金芽胞杆菌(Bacillus thuringiensis)的cry3A启动子Pcry3A、BtI_BtII启动子PBtI_BtII和来自蜡状芽胞杆菌特异启动子P44-12以研究其表达差异。其中,Pcry3A和PBtI_BtII分别与gfpmut3构成融合基因,以调控gfpmut3在苏云金芽胞杆菌中的表达。将重组质粒pGFP_304(含P44-12)、pGFPExpA(含Pcry3A_ gfpmut3融合基因)和pGFPExpB(含PBtI_BtII_ gfpmut3融合基因)分别导入大肠杆菌(Escherichia coli)和苏云金芽胞杆菌后发现,P44-12和PBtI_BtII在大肠杆菌与苏云金芽胞杆菌中均可表达gfpmut3,其中PBtI_BtII在大肠杆菌中具有极强的启动基因表达的能力。而Pcry3A不能启动gfpmut3在大肠杆菌中表达,在苏云金芽胞杆菌中启动的gfpmut3表达的荧光强度也较弱。进一步通过荧光显微镜和生物活性检测器对含重组质粒pGFP_304、pGFPExpA和pGFPExpB的转化子分别进行荧光检测及微量热检测。结果表明,3种启动子驱动下的gfpmut3基因均可在苏云金芽胞杆菌无晶体突变株BMB171中表达并检测得到不同的发光类型。微量热法检测发现P44_12和PBtI_BtII启动gfpmut3表达的代谢热低于Pcry3A驱动gfpmut3表达的代谢热。     

我国分离的肠道病毒71型(SHZH03病毒株)全基因组核苷酸序列分析

对肠道病毒71型(enterovirus 71,EV71)中国(深圳)分离株SHZH03进行了全基因组(未包括多聚腺苷尾)7406个碱基的核苷酸序列测定.结果表明,SHZH03株与其它肠道病毒71型毒株相比,在编码区没有核苷酸的缺失和插入,其5′UTR和3′UTR区的长度和序列有一定的差异.核苷酸同源性比较结果表明,在P1区SHZH03株与SHZH98株、中国台湾流行株(TW2086、TW2272)的同源性较高(分别为92.5%,90.1%和87.9%),与新加坡流行株SIN5666、SIN5865及标准株MS、BrCr的同源性则在81%左右,而与Coxsackievirus A16(Cox.A16)的同源性最低(63.6%).氨基酸同源性比较结果表明,在P1区SHZH03株与Cox. A16的同源性最低,但在P2和P3区SHZH03株与Cox.A16的同源性最高.P1区的遗传进化分析表明,SHZH03株和中国台湾1998年流行的EV71毒株的亲缘关系较近,属于同一型(genogroup),而与标准株BrCr和MS的亲缘关系较远.上述结果有助于肠道病毒71型的基础研究和中国对于EV71所致疾病的预防.     

苏云金芽胞杆菌产苏云金素菌株CT-43及其 缺失突变株的差异蛋白

[目的]苏云金素(Thuringiensin)的合成和代谢途径的相关研究在国内外一直进展缓慢,本文拟从蛋白质组水平揭示与苏云金素合成或代谢相关的蛋白.[方法]利用双向电泳技术研究了高产苏云金素的苏云金芽胞杆菌野生菌株CT-43、其高产突变菌株CT-43-1C及不产突变菌株BMB0806在蛋白表达水平的差异,然后对差异蛋白点进行质谱鉴定,最后对鉴定出的蛋白进行生物信息学分析.[结果]与野生型和高产菌株相比,在BMB0806中发现了13个差异显著的蛋白点,鉴定出了其中的9个,生物信息学结果显示有6个蛋白可能与苏云金素合成或代谢相关.[结论]通过蛋白质组研究找到了6个可能与苏云金素合成或代谢相关的蛋白,为苏云金素合成基因簇的克隆和合成途径的验证提供了有力的证据.     

苏云金芽胞杆菌营养期杀虫蛋白基因的克隆及表达分析

选择本实验室分离的苏云金芽胞杆菌李氏亚种 (subsp. Leesis) 菌株YBT833、鲇泽亚种(subsp.Aizawai) 菌株YBT-1416和库斯塔克亚种(subsp. Kurstaki)菌株YBT1535为出发菌株,以营养期杀虫蛋白基因PCR扩增的特异片段为探针,进行总DNA酶切片段的Southern杂交定位。结果显示3株菌株的营养期杀虫蛋白基因,均位于经XbaI完全消化的4～5kb大小的DNA 片段上。将该区域DNA片段回收后克隆到pUC19载体,建立了3个较基因组文库小的亚基因组文库。通过菌落原位杂交筛选和酶切鉴定分别得到3个相应的营养期杀虫蛋白基因vip83、vip14和vip15,并对其测序。DNA序列比较发现基因vip83与已知营养期杀虫蛋白基因存在5个差异碱基。将vip83、vip14基因亚克隆到苏云金芽胞杆菌大肠杆菌穿梭载体pHT315, 分别得到重组质粒pBMB8901和pBMB8902。将它们电转化到vip^-的B.t.受体菌BMB171和4Q7,获得了相应的工程菌BMB8901-171,BMB8902-171,BMB8901-4Q7和BMB8902-4Q7。SDS-PAGE电泳检测均有88kD大小的蛋白表达。生物测定结果亦表明了,营养期杀虫蛋白Vip83和Vip14对鳞翅目棉铃虫、小菜蛾和甜菜夜蛾的三龄幼虫均有一定的杀虫活性;其中对小菜蛾的毒力最高,LC₅₀值分别为28.6,31.6,45.4和37.6μL/mL。该结果为构建高效广谱工程菌提供了实际材料和理论依据。      

影响库蚊幼虫摄食鱼腥藻的因素

在实验室条件下,致乏库蚊幼虫可大量摄食鱼腥藻,并能消化利用,完成生活史。鱼腥藻在蚊幼虫肠道中滞留时间约6h,酵母约5h,鱼腥藻比酵母稍难消化。对比幼虫孵化至化蛹周期,饲喂鱼腥藻为194h,而饲喂酵母则为142h,饲喂鱼腥藻比饲喂酵母延缓了蚊幼虫期52h。致乏库蚊幼虫摄食鱼腥藻的适宜条件为:pH7-8,温度25-30℃,藻液浓度愈高,摄食越多。随着蚊幼虫的生长,摄食量递增。     

含质粒复制起始区ori44的苏云金芽胞杆菌解离载体的构建

将苏云金芽胞杆菌转座子Tn4430的解离酶识别位点res分别插入克隆载体pRSET B和pUC19得到质粒pBMB1201和pBMB1202。这两个质粒分别经BamHI/HindⅢ和EcoRI/HindⅢ双酶切回收含res位点的小DNA片段,与穿梭载体pHT3101经EcoRI/HindⅢ双酶切后回收的含大肠杆菌复制起始区、氨苄青霉素抗性基因和红霉素抗性基因的3.3kb片段连接,获得重组质粒pBMB1203。封闭pBMB1203两res位点外的BamHI和EcoRI位点后,得到解离载体pBMB1204。将来源于苏云金芽胞杆菌库斯塔克亚种YBT-1520的质粒复制起始区ori44片段插入pBMB1204的两res位点之间,得到解离穿梭载体pBMB1205。该解离载体插入壮观霉素抗性基因后电转化无晶体突变株,在辅助质粒所提供的解离酶作用下可发生解离消除抗性基因,解离频率为100%,解离后的质粒稳定性为93%。利用解离穿梭载体pBMB1205可在用抗性筛选到转化子后特定消除抗性标记基因和其它非苏云金芽胞杆菌DNA片段。     

苏云金芽胞杆菌营养期杀虫蛋白Vip与Cry蛋白的协同作用

将构建的营养期杀虫蛋白基因vip3表达质粒pBMB2328和含杀虫晶体蛋白基因(crylAc10或crylCa)质粒同时电转化无质粒突变株BMB171并双抗筛选。经PCR特异引物扩增验证,分别得到含crylAc10和vip83、crylCa和vip83的双基因重组菌BMB2830-171和BMB2882-171。用单基因重组菌作对照,分别测定了营养期杀虫蛋白Vip83与杀虫晶体蛋白CrylAc10和Cry1Ca两组蛋白对3种重要鳞翅目害虫毒力。经统计分析,结果表明两组杀虫蛋白Vip83与CrylAc10和Vip83与CrylCa之间对棉铃虫均存在拮抗作用,对甜菜夜蛾协同作用不明显;但对小菜蛾前协同作用不明显,而后则有增效作用,其共毒系数为32．6。双基因的遗传稳定性检测表明这种正负协同关系具有一定的分子遗传稳定性,可为高效广谱工程菌的构建提供依据。     

细菌表面S-层的结构及其功能和应用前景

细菌的细胞外壁一般由细胞壁和细胞膜组成 ,除此之外 ,在许多古细菌和真细菌中还有一层表面结构 ,称为表面层 (Ｓｕｒｆａｃｅｌａｙｅｒｓ)或称为Ｓ 层 (Ｓ ｌａｙｅｒｓ) ,它们是由蛋白质组成的晶格状结构 ,位于细胞壁或细胞膜外层 ,是生物进化过程中最简单的一种生物膜[1,2 ] 。图 1　细菌细胞表面Ｓ 层的冰冻蚀刻电镜照片[3 ]1　Ｓ 层的形态结构细菌的每一个分类群都存在Ｓ 层 ,涉及 3 0 0多个种 ,其中在古细菌中分布更广。与大多数原核细胞的其它表层结构不同 ,Ｓ 层只有通过电镜 ,特别是冰冻蚀刻技术才能清晰地观察到。在真细菌和古细…