红树林源白骨壤链霉菌中多环稠合大环内酰胺类化合物的结构多样性研究

【目的】通过基因组挖掘的方法,研究红树林来源白骨壤链霉菌Streptomyces avicenniae 9-9中多环稠合大环内酰胺(PTMs)类化合物的结构多样性。【方法】通过生物信息学分析白骨壤链霉菌基因组序列,寻找PTMs类化合物的生物合成相关基因;利用UPLC-MS/MS技术对该菌的次级代谢产物进行分析。【结果】在白骨壤链霉菌基因组中发现PTMs生物合成基因簇(aviA-D);从菌液提取物中鉴定出5个PTMs类化合物,其中包括ikarugamycin(化合物1)和capsimycin B(化合物2);基于PTMs类化合物5-6-5环类型的MS/MS碎裂规律,对化合物3–5的结构进行了推测。【结论】红树林来源白骨壤链霉菌S.avicenniae 9-9具有产生5-6-5环类型的PTMs类化合物的能力。     

植物病原黄单胞菌退出群体感应生理状态的分子机制和生物学意义

黄单胞菌是一类引起多种作物病害的病原细菌总称。它们利用自身产生的DSF(Diffusible signaling factor)-家族群体感应(quorum sensing,QS)信号分子感应群体密度,调控致病相关基因的表达。当黄单胞菌培养达到对数生长后期时,培养体系中DSF信号分子浓度迅速降低,呈现一种典型的群体感应信号反转(turnover)现象。编码脂酰辅酶A连接酶的基因rpfB在黄单胞菌生长后期表达量显著提高,敲除rpfB导致DSF生物合成显著提高,因此,RpfB参与DSF-家族QS信号分子的降解,在群体感应后期引导黄单胞菌退出群体感应状态。DSF信号通过RpfC/RpfG双组分系统、环二鸟苷酸和全局性转录因子Clp负调控rpfB的表达。DSF群体感应信号关键降解基因rpfB存在于多种细菌中,表明该信号反转机制相对保守,但其调控的生物学功能因菌而异。     

嗜热丁烷氧化古菌Candidatus Syntrophoarchaeum烷基转移酶MtaA催化丁基辅酶M的分子机制研究

【背景】嗜热古菌Candidatus Syntrophoarchaeum可以与硫酸盐还原细菌共生,通过逆转产甲烷途径进行正丁烷的氧化,但在该过程中负责催化丁基辅酶M氧化的酶尚未确定。【目的】利用分子动力学模拟证明Ca.Syntrophoarchaeum中mta A基因编码的蛋白可以特异性催化丁基辅酶M中丁基的转移,并非转移甲基。【方法】使用Methanosarcina mazei辅酶M甲基转移酶Mta A的晶体结构(PDB ID:4ay8)作为模板,对Mta A_1 (Gen Bank登录号OFV65993.1)和Mta A_2 (Gen Bank登录号OFV65678.1)进行同源建模。使用分子对接得到两者分别结合CH_3-Co M和C_4H_9-Co M时的结构,并用AMBER18进行分子动力学模拟。【结果】当Mta A_1和Mta A_2分别结合C_4H_9-Co M时,表现出与4ay8晶体结构类似的TIM-Barrel折叠三维结构,但在活性中心形状、Zn~(2+)与底物距离以及活性位点附近氨基酸配位方式等方面存在差异,这可能是导致Ca.Syntrophoarchaeum中mta A基因编码的蛋白催化丁基辅酶M氧化的原因。其中Mta A_2与4ay8结构更相似,活性中心氨基酸配位更完整,暗示其更可能具备催化活性。然而当Mta A_1和Mta A_2分别结合CH_3-Co M时,整体结构不合实际,活性中心Zn~(2+)与底物距离过远,表明底物几乎不可能与酶结合。【结论】Ca.Syntrophoarchaeum中的Mta A_1和Mta A_2很可能是特异性的丁基转移酶,而非催化甲基的转移,其中Mta A_2具备活性的可能性更高。     

V型羊毛硫肽雷可肽的抑菌机制

【背景】雷可肽(Lexapeptide)为首例V型羊毛硫肽家族化合物,具有较好的抗革兰氏阳性菌活性,对耐甲氧西林金黄色葡萄球菌(Methicillin-Resistant Staphylococcus aureus,MRSA)和表皮葡萄球菌(Methicillin-Resistant Staphylococcus epidermidis,MRSE)的抑制作用强于广泛应用的食品防腐剂乳酸链球菌素,其对pH和高温的稳定性也优于乳酸链球菌素,具有较好的应用前景。由于抑菌机制不明确,限制了雷可肽的开发应用。【目的】探究雷可肽抑菌作用特征以及作用机制,为雷可肽开发应用奠定基础。【方法】通过菌落计数法与Mg2+试验表征雷可肽抑菌动力学曲线;采用流式细胞仪和透射电子显微镜研究雷可肽在靶细胞表面的成孔性;利用高效液相色谱与基质辅助激光解吸电离的时间飞行质谱分析雷可肽处理对革兰氏阳性菌肽聚糖前体积累的影响。【结果】雷可肽在抑菌动力学上与乳酸链球菌素没有显著差别,但在更宽的Mg2+浓度范围内仍可保持抑菌活性。雷可肽处理后的细胞具有透过荧光染料的能力,生物型透射电镜观察到细胞发生破损。此外,在雷可肽作用后的细胞中检测到肽聚糖合成的前体尿嘧啶核苷二磷酸-N-乙酰胞壁酸五肽。【结论】雷可肽能够通过抑制细胞壁肽聚糖生物合成并造成细胞损伤进而获得通透性,以此来抑制革兰氏阳性菌生长。     

拟南芥ATGs在发育和非生物胁迫中的表达特征和功能分析

植物细胞自噬(Autophagy)是依赖于液泡来降解体内异常蛋白的重要途径,其中ATGs (Autophagyrelated genes)蛋白对该途径中的核心组分自噬体的形成至关重要。目前在模式植物拟南芥中已经鉴定到35个ATGs,它们对细胞自噬的发生和调节起到关键作用,然而全面地认知植物ATGs在生长发育和逆境中的转录表达变化尚有不足。本研究通过收集公共数据库中的转录组数据,利用生物信息学方法挖掘了拟南芥ATGs的表达信息,展示了其在47个不同发育时期或组织部位的表达聚类情况,对比分析了ATGs在植物非生物胁迫情况下的地上部分(茎)和地下部分(根)的表达差异,同时结合ATGs的启动子组分分析,阐明ATGs表达的时空变化可能的调控分子机制。本研究将为进一步探索ATGs在生长发育和非生物胁迫中的功能提供基础数据和相关依据。     

基于化学遗传学筛选产萘醌类化合物内生放线菌

【目的】为探究含具有抗肿瘤活性的美登素的滑桃(Trewia nudiflora)种子中内生放线菌的多样性,以及从内生放线菌中寻找萘醌类化合物产生菌。【方法】利用放线菌富集筛选培养基对经消毒处理的滑桃种子进行内生菌分离,根据菌落形态及16S rRNA基因序列分析进行菌种的分类鉴定。通过对所分离到的内生放线菌拮抗模式病原细菌(金黄色葡萄球菌、铜绿假单胞菌)、作物病原真菌(小麦赤霉菌、水稻纹枯病致病菌等)活性检测,以及萘醌类化合物合成关键基因为探针定向筛选萘醌类化合物产生菌。【结果】从分离到的100余株滑桃种子内生菌中鉴定出66株以链霉菌为主的放线菌,发现Streptomyces sp.HTZ27菌株含有目标基因,经固体发酵、化合物分离纯化、鉴定后,发现该菌发酵产物中有呋喃萘醌I,得率接近5 mg/L。【意义】本研究采用的化学遗传学方法可有效提高筛选目标化合物产生菌的效率,所筛选到FNQ I产生菌为深入研究呋喃萘醌类化合物生物合成与调控、抗肿瘤分子机理以及产业化应用等创建了有利条件。     

杀念菌素/FR-008生物合成途径中转运基因fscTⅠ与fscTⅡ的功能

[目的]分析杀念菌素/FR-008生物合成途径中转运基因fscTⅠ和ficTⅡ的功能.[方法]构建转运基因fscTⅠ和fscTⅡ的敲除质粒pJTU4137,并通过接合转移和同源重组双交换的方法得到转运基因缺失突变株.转运基因fscTⅠ和ficTⅡ也被克隆到高拷贝质粒pJTU 1278上用于在链霉菌FR-008(Streptomyces sp.FR-008)的衍生菌株ZYJ-6中进行转运蛋白的过量表达.[结果]获得了转运蛋白缺失的双交换突变株LX10,发酵结果显示该突变株不再产生杀念菌素及其衍生物 ;过量表达转运蛋白的基因工程菌株LX11,其杀念菌素的产量约是对照菌株的1.5倍.[结论]体内遗传实验进一步证实FR-008生物合成途径中的fscTⅠ和fscTⅡ是ATP依赖的ABC转运基因,fscTⅠ与fscTⅡ的过量表达增加了杀念菌素的产量,为利用此方法提高其它多烯类抗生素的产量提供了例证.     

DNA末端硫修饰依赖的体外大片段DNA连接法

【背景】DNA组装技术是基因组合成中的一个关键技术。探索低成本、高效率的基因组合成技术一直是合成生物学的重要研究领域。在某些细菌如变铅青链霉菌中,DNA上有磷硫酰化修饰(简称硫修饰),而在另一些细菌如天蓝色链霉菌中存在一种含有硫修饰识别结构域(sulfur-binding domain, SBD)的识别蛋白,可以特异性识别DNA上的硫修饰,这启发了我们发展出一种新的DNA组装技术。【目的】探究在DNA末端硫修饰的连接中,T4 DNA连接酶与SBD相融合蛋白和单独的T4 DNA连接酶相比,是否有更高的连接效率。【方法】根据同源重组原理,设计硫修饰引物,扩增硫修饰的DNA片段。构建T4 DNA连接酶与SBD融合蛋白的3种表达载体T4-linker-SBD(Hga)、T4-linker-SBD(Spr)和T4-linker-SBD(Mmo),表达纯化以上3种融合蛋白。比较3组浓度梯度(2.4、0.24、0.024 mg/mL) T4 DNA连接酶与融合蛋白在2.5 kb和8.0 kb DNA片段连接上的差异。【结果】DNA末端硫修饰的2.5kb和8.0kb的两端片段均能扩增,而且3种融合蛋白...