铜绿假单胞菌生物被膜组成及其受群体感应系统和c-di-GMP调控的研究进展

作为人类条件性感染的前三大病原菌之一的铜绿假单胞菌,是一种革兰氏阴性细菌,对免疫功能低下和囊性纤维化患者可以造成严重和持续性感染。造成这种持续感染的原因主要是由于细菌接收外界信号后,在自身调控网络的协同作用下,会依附于固体表面,并产生胞外多糖、基质蛋白和胞外DNA等大分子物质形成高度结构化的膜状复合物将自身包裹形成生物被膜群体结构。生物被膜可以有效帮助细菌定殖、提高细菌对抗菌物质和宿主免疫反应的抵抗能力、促进群落细菌的细胞-细胞之间的信号交流等,是临床治疗中病原菌慢性感染和反复感染最重要的原因之一。本篇综述重点介绍了铜绿假单胞菌生物被膜的各组成成分及其在生物被膜形成中的重要功能,并进一步阐述了群体感应系统(las、rhl、pqs与iqs)和c-di-GMP对铜绿假单胞菌生物被膜形成的调控作用。通过本篇综述可以更清晰地了解细菌生物被膜形成和调控的过程,为开发新的治疗生物被膜感染策略提供帮助。     

分离自苏云金芽胞杆菌的首例细菌乌头酸异构酶TbrA的酶学性质研究

【目的】乌头酸异构酶(aconitate isomerase,AI)可介导具有多重生物学活性及应用潜力的小分子物质反式乌头酸(trans-aconiticacid,TAA)的合成。本文通过表征来自苏云金芽胞杆菌的生物体首条AI基因(tbrA)的产物——TbrA蛋白的催化性质,填补人们对于AI酶学特性的认识。【方法】我们利用大肠杆菌Rosetta菌株和Ni²⁺柱亲和纯化获得了His6-TbrA蛋白,并在体外通过HPLC检测了产物生成及对应酶活。【结果】TbrA蛋白的最适pH、温度与离子强度分别为8.0,37°C和25 mmol/L。TbrA在10°C时仍保留约60%的活性,展现了较好的耐低温特性。金属离子Mg²⁺、Ca²⁺与还原剂DTT可显著增强TbrA活性,而Fe²⁺、Cu²⁺、Zn²⁺、Mn²⁺则强烈抑制TbrA活性。TbrA将顺式乌头酸(cis-aconitic acid,CAA)异构为TAA的正反应Km、Vmax、kcat、kcat/Km值分别为6.25mmol/L、1.39μmol/(L·s)、4.081/s、0.65L/(mmol·s),将TAA异构为CAA的逆反应的上述数值分别为71.50mmol/L、4.17μmol/(L·s)、12.25 1/s、0.17 L/(mmol·s)。【结论】AI酶蛋白TbrA可以在温和的理化条件下表现出最高活性,且更倾向于合成TAA。本研究定量描述了TbrA催化特性,为其今后应用于TAA工业生物合成奠定基础。     

培养条件对双歧杆菌EPS各组分产量及比例的影响

【目的】动物双歧杆菌RH产生的胞外多糖(exopolysaccharides, EPS)经阴离子交换柱层析可获得EPSa和EPSb两个组分。得到可提高EPS的总产量, 尤其是EPSb产量的最佳培养基和培养条件。【方法】对培养基类型、氮源、碳源、碳源浓度、培养基初始pH值、培养温度和时间对双歧杆菌EPSa和EPSb产量的影响进行分析。【结果】在初始pH值调整为7.0的含5%蔗糖的PTYG培养基上, 在35 °C温度下厌氧培养60 h时动物双歧杆菌RH的EPSa和EPSb产量分别为0.982±0.003 g/L和0.312±0.001 g/L。【结论】在上述条件下EPS总产量高且可获得较多的EPSb。     

植物EXO70基因家族的研究进展

胞吐是存在于所有真核生物的一种极其重要的细胞活动,直接参与了激素和神经信号的分泌、细胞生长、细胞极性的建立,细胞分裂和细胞壁的形成等多项生理过程。在胞吐过程中,高尔基后转运膜泡与靶膜的识别是由进化上高度保守的胞泌复合体（exocyst）介导的。该复合体由8个蛋白亚基构成,其中EXO70是组成胞泌复合体功能的关键亚基,可与小G蛋白和膜脂互作,参与复合体在靶膜组装。目前,对植物胞泌复合体功能的了解非常有限,已有证据显示其广泛参与了细胞生长,细胞壁形成、细胞分裂等多种生物学过程。与酵母和动物相比,植物胞泌复合体的一个显著特征是：EXO70在高等植物基因组中存在多个同源基因,其具体生物学功能尚不清楚。本文综述胞泌复合体的研究进展,重点讨论植物EXO70的多基因家族,推测不同的EXO70可能参与了组织细胞或运载底物特异的膜泡转运过程。     

钾离子对长柄扁桃不定芽诱导的影响

研究了钾离子对长柄扁桃不定芽诱导的影响,结果表明,在MS基本培养基中添加800～1200mg·L-1钾离子有利于长柄扁桃不定芽的形成和生长,不定芽的诱导率和数量分别比对照提高了17％和84％,不定芽的平均高度提高了64％;高浓度钾离子（〉1600mg·L。）可导致长柄扁桃不定芽严重褐化。生理指标测定结果表明,适当浓度的钾离子提高了抗氧化酶（SODPOD）的活性和不定芽的组织细胞活力;高剂量的钾离子（〉1600mg·L-1）显著增加了不定芽中MDA的含量。     

铜绿假单胞菌pfm基因对三型分泌系统效应蛋白的影响

[目的]检测铜绿假单胞菌基因pfm对三型分泌系统效应蛋白的影响.[方法]构建pfm基因互补菌株pfmC.提取野生株PAO1、敲除株Δpfm和互补株pfmC的RNA,利用Real-time PCR从转录水平检测效应蛋白ExoS、ExoT和ExoY转录水平的变化.以ExoS为代表,检测细胞内和分泌到细胞外效应蛋白的含量.收集铜绿假单胞菌PAO1、Δpfm和pfmC菌体内和分泌到细胞外的总蛋白,利用ExoS多克隆抗体进行Western杂交,特异检测ExoS的蛋白水平.[结果]与野生型相比,Δpfm中exoS、exoT和exoY转录水平明显降低,而pfmC中这3个蛋白的转录水平得到回补.Δpfm菌体内和分泌到细胞外的ExoS量均明显低于野生株PAO1,pfmC细胞内和细胞外分泌的ExoS蛋白量均得到恢复.[结论]铜绿假单胞菌基因pfm会影响三型分泌系统效应蛋白的水平.     

Pip介导铜绿假单胞菌吩嗪基因簇phz2的表达

[目的]为了确定铜绿假单胞菌调控因子Pip对两个不同吩嗪合成基因簇(phz1和phz2)的具体调控方式与可能的调控机制.[方法]根据基因比对结果,采用同源重组技术构建Pip调控因子缺失突变株PA-PG以及克隆ip基因作互补分析;再以已构建的吩嗪基因簇缺失突变株PA-Z1G和PA-Z2K为受体菌,构建突变株PA-PD-Z1G和PA-PG-Z2K,测定并比较野生株及相关突变株的吩嗪-1-羧酸和绿脓菌素的合成量,推定Pip对两个不同吩嗪合成基因簇的调控方式.[结果]在GA培养基中,突变株PA-PG的吩嗪-1-羧酸和绿脓菌素都比野生型明显减少;互补分析显示,突变株PA-PG的吩嗪-1-羧酸和绿脓菌素都显著提高并恢复到野生株PAO1水平;突变株PA-Z1G的吩嗪-1-羧酸和绿脓菌素合成量因Pip缺失而显著减少;而突变株PA-Z2K的吩嗪-1-羧酸和绿脓菌素合成量在Pip缺失后仍保持不变.[结论]初步推定,转录调控因子Pip对铜绿假单胞菌吩嗪合成代谢的确具有促进作用;Pip通过正向调控吩嗪基因簇phz2的合成功能实现对吩嗪合成代谢的调控.     

五种假单胞菌的分离鉴定及其生物活性

【目的】从湖南长沙市采集到的土样中分离假单胞菌并进行归类,研究各菌株抑菌和抗肿瘤生物活性,以丰富假单胞菌菌种资源并为微生物次级代谢物的挖掘奠定基础。【方法】采用大蜡螟诱集法诱集分离假单胞菌,结合形态观察、生理生化特征和16S rRNA基因序列同源性分析,鉴定并归类各细菌,通过平板扩散法、对峙培养法和肿瘤细胞毒性试验分别研究各菌株抑制细菌、拮抗真菌和抗肿瘤细胞等生物活性。【结果】从湖南长沙市郊区菜地、林地中分离得到5株假单胞菌,归类并命名为Pseudomonas protegens CY01、绿针假单胞菌CY02(Pseudomonas chlororaphis CY02)、栖稻假单胞菌CY04(Pseudomonas oryzihabitans CY04)、Pseudomonas sp.CY05和恶臭假单胞菌CY06(Pseudomonas putida CY06)。P.protegens CY01和P.chlororaphis CY02对枯草芽胞杆菌(Bacillus subtillis)和金黄色葡萄球菌(Staphylococcus aureus)具有较好的抑菌效果,P.chlororaphis CY02对水稻稻瘟病菌(Pyricularia oryzae)具有良好的拮抗作用,对小鼠黑色素瘤细胞B16具有较强的细胞毒性。【结论】分离得到的P.chlororaphis CY02,在抑制病原细菌、拮抗水稻稻瘟病菌和抗肿瘤细胞等方面具有显著效果。     

重组大肠杆菌表达铜绿假单胞菌溶血性磷脂酶C

[目的]构建产溶血性磷脂酶C (Hemolytic Phospholipase C,PLCH)的重组大肠杆菌(Escherich coli菌株,并初步优化其发酵条件.[方法]首先利用卵黄硼砂平板分离法筛选到一株产磷脂酶C(Phospholipase C,PLC)活性较高的菌株,命名为铜绿假单胞菌(Pseudomonas aeruginosa)41;进一步以P.aeruginosa 41基因组DNA为模板设计引物,PCR扩增获得溶血性磷脂酶C(PLCH)基因,构建重组大肠杆菌表达质粒并转化大肠杆菌E.coli BL21 (DE3);筛选转化子并检测PLC活性和溶血能力,并初步优化其发酵条件.[结果]成功构建了重组大肠杆菌E.coli BL21(DE3) /pET28a-plcH;在硼砂卵黄平板上对重组菌进行PLC活性测定,显示重组菌有明显的磷脂酶C活性;在哥伦比亚血琼脂平板上对重组菌进行溶血性试验,表明PLCH具有较强的溶血活性;初步优化摇瓶发酵条件为:5％转接量,37℃、200 r/min下培养4h添加IPTG至终浓度为0.9 mmol/L,转为25℃、150 r/min诱导培养14 h;优化后重组菌的酶活可达到722.89±0.47 U/mL.[结论]本文成功构建了一株产溶血性磷脂酶C活性较高的重组大肠杆菌菌株,并通过优化发酵条件使其酶活达到了722.89±0.47 U/mL,本实验在国内首次实现了铜绿假单胞菌来源的溶血性磷脂酶C基因在大肠杆菌的胞内表达,该研究为研究磷脂酶C产业化奠定了一定的基础.     

多粘类芽胞杆菌SC2基因敲除体系的建立

摘要:【目的】建立多粘类芽胞杆菌SC2 的基因敲除体系。【方法】利用电转化把温敏型自杀质粒pRN5101导入到多粘类芽胞杆菌SC2中。采用基因重组技术敲除SC2 中的多粘菌素基因E(pmxE),得到突变株SC2-E。利用抗细菌性能检测和高效液相色谱分析合成多粘菌素的能力,来证实pmxE基因是否被敲除。【结果】成功构建了多粘类芽胞杆菌SC2 的基因敲除体系。pRN5101转入SC2后能够在28℃复制,39℃自杀。突变株失去了合成多粘菌素的能力,成功敲除pmxE基因,验证了此体系的可用性。【结论】首次构建了多粘类芽胞杆菌的基因敲除体系,拓展了pRN5101的使用范围,为研究多粘类芽胞杆菌的基因功能提供了高效的遗传操作工具。