麦芽四糖淀粉酶基因优化表达及酶学性质分析

麦芽四糖淀粉酶是一种新型外切淀粉酶,从淀粉的非还原末端特异地顺序切割第4个α-1,4糖苷键,产物为麦芽四糖,广泛应用于食品、医疗保健等领域.对来自嗜糖假单胞菌(Pseudomonas saccharophila)的麦芽四糖淀粉酶基因序列进行优化,优化前后基因序列同源性达75％.将优化合成的成熟肽基因克隆至原核表达载体pET32a(+)上,转化大肠杆菌BL21(DE3),经IPTG诱导,重组蛋白主要以包涵体形式存在.包涵体经变性、复性、多步纯化,获得有活性的麦芽四糖淀粉酶.将麦芽四糖淀粉酶与不同来源的淀粉水解反应,结果表明,该酶能与7种不同来源的淀粉反应产生单一的麦芽四糖.经SDS-PAGE电泳,DNS法和硅胶板薄层色谱分析法(TLC)进行酶学性质分析,结果表明麦芽四糖淀粉酶的分子量约为57kDa,纯化后的酶液最适反应温度为45℃,最适反应pH为8.0.研究结果为麦芽四糖淀粉酶的研究和开发提供依据和参考.     

不同启动子调控羰基还原酶基因在枯草芽胞杆菌中的表达水平

为了实现羰基还原酶基因mldh在枯草芽胞杆菌中的高效表达,以摩氏摩根菌MorganellamorganiiCMCC（B）49208染色体DNA为模板,PCR扩增得到目的基因mldh,分别与启动子PQ和启动子p43进行连接,构建不同启动子组合的表达载体PHY—p43-mldh、PHY—PQ—mldh、PHY—p43-p43-mldh和PHY—p43-PQ—mldh,化学法转化B．subtilisWb600后对重组茵细胞破碎液进行SDS-PAGE分析及全细胞生物转化反应实验发现,4种重组茵的转化能力差异显著,其中重组菌B．subtilisWb600（PHY—p43-p43-mldh）进行全细胞转化反应,转化液中d-伪麻黄碱的浓度最高,达到142．1mg／L,底物转化率为78．25％,成功实现了羰基还原酶基因mldh在枯草芽胞杆菌中的高效表达。     

江西铅山红芽芋脱毒苗球茎愈伤组织诱导及其再生体系的建立

以江西铅山红芽芋脱毒苗为试材,研究不同因素对红芽芋脱毒苗球茎愈伤组织诱导及其再生体系的影响,以期对红芽芋脱毒苗的再生体系进行优化。结果表明,红芽芋脱毒苗球茎愈伤组织诱导的最佳培养基是MS+TDZ 2 mg·L^-1+2,4-D 1 mg·L^-1。红芽芋脱毒苗球茎愈伤组织分化的最佳培养基是MS+TDZ 2 mg·L^-1+NAA 1 mg·L^-1。红芽芋脱毒苗不定芽生根的最佳培养基是1/2MS+NAA 0.5 mg·L^-1+PP₃₃₃ 0.5 mg·L^-1。红芽芋再生苗最好的移栽基质为发酵后的腐锯木屑。红芽芋脱毒苗球茎愈伤组织再生苗移栽时最佳的PP₃₃₃浓度为20～50 mg·L^-1。本试验成功建立了红芽芋脱毒苗球茎愈伤组织的再生体系,为红芽芋脱毒苗转基因的研究和种质创新奠定了基础。     

短芽胞杆菌对香蕉采后炭疽病的防治

【背景】香蕉炭疽病是香蕉贮运过程中常见的病害,危害严重。【目的】评价短芽胞杆菌菌株FJAT-17214和FJAT-10657的抗菌活性,并进行菌株鉴定。【方法】采用抑菌圈法和菌丝生长速率法对菌株FJAT-17214和FJAT-10657的拮抗活性进行测定,采用香蕉果实回接法测定这2株菌对香蕉采后炭疽病病原菌的抗菌活性;根据菌株FJAT-17214和FJAT-10657的形态观察、特异性鉴定和16SrRNA基因序列进行种属鉴定。【结果】菌株FJAT-17214和FJAT-10657发酵上清液对香蕉炭疽病病原菌菌丝生长具有抑制作用,抑菌圈直径分别达到15.30 mm和15.35 mm。随着菌株培养时间的延长,菌株FJAT-17214和FJAT-10657发酵上清液抑菌效果也逐渐增强,培养72 h时,抑菌圈直径分别增大至17.37 mm和20.96 mm。不同添加量发酵上清液对香蕉炭疽病病原菌生长均具有一定的抑制作用。当培养基中添加50 m L菌株FJAT-17214和FJAT-10657的发酵上清液时,其抑菌率可分别达到83.90%和85.84%。接种炭疽病病原菌4 d后,防治效果分别为67.88%和54.55%,处理后香蕉果皮β-1,3-葡聚糖酶活性均明显高于对照。对菌株FJAT-17214和FJAT-10657进行形态学观察、特异性鉴定和16SrRNA基因种属鉴定的结果表明,这2株菌分别被鉴定为短短芽胞杆菌(Brevibacillus brevis)和人参土壤短芽胞杆菌(Brevibacillus panacihumi)。【结论】菌株FJAT-17214和FJAT-10657对香蕉采后炭疽病具有较好的防治效果,可作为采后病害防治微生物的材料。     

碳源影响水稻根际假单胞菌PA1201藤黄绿菌素的生物合成

【背景】假单胞菌PA1201是一株水稻根际促生菌,其产生的次生代谢物藤黄绿菌素(pyoluteorin,Plt)能够有效抑制多种植物病原真菌和细菌的生长,但在常规培养条件下Plt产量极低。【目的】研究碳源对Plt生物合成的影响,为提高Plt的产量以及应用提供理论基础。【方法】将基本培养基(minimal medium,MM)中甘露醇替换为不同的碳源及碳源组合作为PA1201的培养基,生长过程中不同时间点取样提取Plt,利用高效液相色谱(HPLC)法分析Plt的产量变化。【结果】建立了基于HPLC定性和定量检测Plt的方法;比较了PA1201菌株在不同培养基中菌株生长和Plt的产量,发现果糖和甘露醇促进Plt生物合成;果糖和甘露醇对Plt生物合成没有增效作用;在含有甘露醇或果糖作为唯一碳源的培养基中,添加葡萄糖或琥珀酸抑制Plt生物合成。【结论】果糖和甘露醇促进水稻根际假单胞菌PA1201合成藤黄绿菌素,这为提高藤黄绿菌素的生物合成效率和促进藤黄绿菌素的应用奠定了基础。     

铜绿假单胞菌PAO1 ku基因缺失菌株的构建及其对生物被膜耐药性的影响

【背景】铜绿假单胞菌是常见的条件致病菌,易形成生物被膜,具有基因突变率高、耐药性强的特点。非同源末端连接是DNA双链断裂的主要修复途径之一,修复过程会导致DNA突变产生。【目的】研究非同源末端连接对生物被膜中的铜绿假单胞菌基因突变率和耐药性的影响。【方法】通过基因无痕敲除的方法构建PAO1菌株的ku基因缺失突变株Δku并构建其回补株。对比研究突变株和野生菌株生物被膜形成能力、生物被膜状态下各菌的基因突变率以及对抗生素的耐受性。通过荧光定量PCR检测生物被膜中PAO1菌株ku基因的表达水平。【结果】各突变株生物被膜形成能力无显著差异;与野生菌株相比,突变株Δku在生物被膜中的基因突变率以及对环丙沙星和庆大霉素的最低抑菌浓度(minimum inhibitory concentration,MIC)下降。荧光定量PCR结果表明,ku基因在生物被膜形成早期转录水平有明显上调。【结论】非同源末端连接修复途径对生物被膜中的铜绿假单胞菌基因突变率以及耐药性的提高有一定的作用。本研究将为后续进一步阐释铜绿假单胞菌耐药产生机制提供一定的理论依据。     

c-di-GMP的磷酸二酯酶PA4781在抗菌肽Merecidin抑制铜绿假单胞菌生物被膜中的作用

【背景】抗菌肽Merecidin可抑制临床菌株铜绿假单胞菌PA03生物被膜。PA4781基因是课题组通过生物信息学分析筛选出的差异表达基因,PA4781作为细菌第二信使分子环二鸟苷酸(cyclic diguanylate,c-di-GMP)的磷酸二酯酶具有降解c-di-GMP的作用,其在抗菌肽Merecidin抑制生物被膜中的作用机制尚不清楚。【目的】研究细菌第二信使分子c-di-GMP的磷酸二酯酶PA4781基因在抗菌肽Merecidin抑制铜绿假单胞菌生物被膜中的作用。【方法】利用单碱基突变技术敲除PA4781基因,Sanger测序方法检测敲除的正确性。采用结晶紫染色法观察PA03菌株、PA4781过表达菌株、PA4781敲除菌株24 h生物被膜生长情况,以及在抗菌肽Merecidin 24、48、72μmol/L作用下各菌株生物被膜的生长情况。采用对羟基联苯溶液显色法检测在抗菌肽Merecidin 48、72μmol/L作用下,PA03菌株、PA4781过表达菌株、PA4781敲除菌株生物被膜藻酸盐的变化情况。【结果】Sanger测序结果显示,用pnCasPABEC系统成功实现了靶点位置的单碱基突变,提前终止了PA4781的转录;结晶紫染色结果显示,培养24h时,在24μmol/L抗菌肽Merecidin作用下PA03菌株、PA4781过表达菌株、PA4781敲除菌株生物被膜形成情况无显著性差异(P0.05),在抗菌肽Merecidin 48、72μmol/L处理下,过表达株与正常株和敲除株有显著性差异(P0.05),生物被膜明显减少,敲除株生物被膜厚度高于PA03组(P0.05)。随着抗菌肽Merecidin浓度升高各组藻酸盐含量下降,其中过表达菌株在抗菌肽Merecidin作用下藻酸盐生成量抑制率最高,可达65%。【结论】抗菌肽Merecidin能够促进细菌第二信使分子磷酸二酯酶PA4781的表达,为抗菌肽Merecidin抑制铜绿假单胞菌生物被膜的作用机制可能通过细菌第二信使分子这一信号途径提供新的研究思路。     

中性粒细胞胞外诱捕网在心血管疾病中的作用

心血管疾病目前被认为是多因素参与的慢性炎症性疾病,中性粒细胞作为机体防御系统的第一道防线,广泛参与心血管疾病的发生发展。近期研究显示,作为先天性免疫吞噬细胞的中性粒细胞,可形成中性粒细胞胞外诱捕网(neutrophil extracellular traps,NETs)促进免疫反应的发展及持续,从而在心血管疾病中发挥重要调控作用。本综述详述了中性粒细胞和NETs在心血管疾病进展中的作用,并讨论了将NETs作为潜在治疗靶点的可能性。     

铜绿假单胞菌锌离子摄取系统的研究进展

锌作为一种结构、催化和信号的成分,在许多生理过程中起着关键的作用。它也是病原微生物生长所必需的,不但参与病原微生物代谢和各种毒力因子的调控,而且是病原微生物在宿主中感染和定殖所必需的。铜绿假单胞菌侵染宿主发挥毒力时,宿主会采取营养免疫的策略来限制体内环境中游离的锌离子浓度而抑制该病原菌的感染和定殖。反过来,铜绿假单胞菌则通过自身的锌离子摄取系统克服宿主的营养免疫防御。本综述重点介绍了铜绿假单胞菌中已知的3种锌离子摄取系统(ZnuABC摄取系统、HmtA摄取系统和CntRLMN摄取系统)和锌摄取调控蛋白Zur,同时分析了其他潜在的锌离子摄取途径,并进一步阐述了铜绿假单胞菌锌离子摄取系统在其侵染宿主发挥毒力时和抵御宿主营养免疫时发挥的重要作用。系统总结铜绿假单胞菌对锌离子的摄取过程,旨在为靶向锌离子摄取系统的新型抗铜绿假单胞菌药物的开发提供指导。