胞嘧啶单碱基编辑技术与λ-Red同源重组技术构建鼠伤寒沙门氏菌SlyA敲除菌株的比较研究

由食源性致病菌引发的食品安全问题是威胁人类健康的重要因素。因此,研究食源性致病菌的感染机理对于控制病原菌危害具有重要意义。[目的] 以常见的食源性致病菌——鼠伤寒沙门氏菌为研究对象,以其发挥重要致病性的转录调控因子SlyA为靶标,比较胞嘧啶单碱基编辑技术（CRISPR/Cas9-guided-Cytidine Base Editor,CBE）和λ-Red同源重组技术在构建鼠伤寒沙门氏菌SlyA敲除菌株方面的方法差异,为鼠伤寒沙门氏菌的基因编辑技术应用提供数据。同时,也为其他类型病原菌的基因编辑技术开发提供有力参考。[方法] 采用PCR、Golden Gate、Sanger测序等方法完成CBE系统以及λ-Red系统的构建以及敲除结果的验证,采用Editor-R软件分析CBE系统的单碱基编辑效率,采用Western blotting在蛋白表达层面对敲除结果进行验证。此外,本研究还结合了表型鉴定的方法验证了基因敲除结果。[结果] 经PCR产物测序鉴定、Western blotting分析及溶血素活性鉴定等结果表明,本研究成功将CBE系统应用于鼠伤寒沙门氏菌slyA的单碱基编辑中,应用前述两种方法构建了鼠伤寒沙门氏菌SlyA敲除菌株。[结论] CBE系统虽然以其操作的简便性在基因编辑中优势明显,但同λ-Red系统相比,该方法需要设立特定的gRNA及PAM位点,在非模式菌株中的普适性较低,且在进行编辑时,CBE系统存在不稳定的问题。尽管如此,但CBE系统在鼠伤寒沙门氏菌中的成功建立,为进一步拓展与完善该菌的基因编辑系统提供了基础。     

四季竹耐盐能力的季节性差异

以四季竹2 a生竹苗为材料,通过盆栽试验设置土壤不同NaCl含量模拟盐胁迫环境,研究其在非生理活跃期的冬季(11-12月份)和生理活跃期的夏季(5-6月份)盐胁迫下的生理响应和叶片脱落情况,以了解四季竹耐盐能力的季节性差异。结果表明,在低土壤NaCl盐分(1‰-2‰)条件下,相同浓度处理45 d的竹苗叶片脱落率和各项生理指标较对照变化在冬季和夏季间差异不大,说明在低盐分条件下四季竹耐盐能力季节性差异不明显。在高土壤NaCl盐分(3‰-5‰)条件下,相同浓度处理45 d的叶片中除可溶性蛋白含量较对照升降幅度冬夏两季基本一致外,叶片脱落率、离子渗漏率、SOD活性、POD活性、脯氨酸含量和叶绿素含量分别较对照增加或降低的幅度冬季均显著小于夏季,并且随土壤NaCl浓度的提高冬夏两季的差异逐渐加大,而丙二醛含量和叶绿素a／叶绿素 b变化规律在夏冬两季间完全相反,说明在高土壤盐分(3‰-5‰)条件下相同浓度、相同时间处理的四季竹在夏季的受伤害程度显著大于冬季,即高盐条件下四季竹在生理活跃期的夏季的耐盐能力较非生理活跃期的冬季弱。土壤盐分和环境温度对四季竹生长具有较强的交互作用。     

食品污染克罗诺杆菌(阪崎肠杆菌)的分离及鉴定

[目的]对300份奶粉样品和50份非奶粉类食品中克罗诺杆菌的污染情况做定量检测,并对分离得到的克罗诺杆菌进行鉴定.[方法]通过分子方法和9管法对奶粉和其他食品中克罗诺杆菌的污染情况做定量检测;通过吲哚产生、丙二酸盐利用、卫矛醇、肌醇、松三糖和松二糖发酵产酸等六种生化试验对分离株进行鉴定;同时对分离株的16S rRNA基因序列进行同源性分析,通过N-J(Neighbour-Joining)法构建系统发育树.[结果]定量检测结果表明,350份样品中有23份样品分离出克罗诺杆菌,共分离到24株克罗诺杆菌,检出率为6.6％;23份受污染样品中有4个样品的克罗诺杆菌大于100 MPN/100g;24株克罗诺杆菌被鉴定到种或亚种,其中19株为阪崎克罗诺杆菌(Cronobacter sakazakii);2株为丙二酸盐克罗诺杆菌(C.malonaticus);2株为都柏林克罗诺杆菌奶粉亚种(C.dublinensis subsp.lactaridi);1株为莫金斯克罗诺杆菌(C.muytjensii).[结论]分子方法和9管法联用适合污染率低而定量检测要求高的克罗诺杆菌的奶粉调查;采用生化和分子生物学方法将24株分离株鉴定到种或亚种,其中阪崎克罗诺杆菌为优势种;奶粉中克罗诺杆菌的污染问题对婴幼儿安全存在隐患,应引起消费者和有关部门的重视.     

河南小秦岭发现红腹角雉和白斑翅拟蜡嘴雀

正2017年6月至2019年12月,运用红外相机在河南小秦岭国家级自然保护区(34°23′～34°31′N,110°23′～110°44′E,海拔1 427～2 246 m)7个位点分别拍摄到红腹角雉(Tragopan temminckii)和白斑翅拟蜡嘴雀(Mycerobas carnipes)(图1)。2019年4月3日至2019年10月9日拍摄到红腹角雉雌性6次、雄性3次,2019年6月26日和2019年6月29日拍摄到雌性带幼鸟各1次。2018年12月2日至2019年3月16日拍摄到白斑翅拟蜡嘴雀雌性5次、雄性4次,2018年12月2日同时拍到雌性和雄性1次。     

致瘿昆虫对寄主植物生理和代谢的影响

虫瘿是致瘿昆虫刺激植物后诱导形成的畸形结构,是研究植物与昆虫协同进化的理想材料,同时致瘿昆虫通常还是重要的农林害虫。因此,研究致瘿昆虫对寄主植物的影响,一方面可进一步揭示致瘿昆虫与植物的关系,有助于揭示成瘿植物生长的一般过程;另一方面,了解成瘿植物对致瘿昆虫的响应有助于筛选植物抗性指标、抗性基因、敏感基因等,为抗性育种提供理论基础。本文主要围绕致瘿昆虫对寄主植物光合作用、生理和代谢活动的影响等进行了综述。致瘿昆虫普遍引起寄主植物光合色素减少、光合速率降低,虫瘿内部组织中糖类、氨基酸类等初生代谢物质含量增加,虫瘿外部组织中酚类、黄酮类等非挥发性和萜类为主的挥发性次生代谢物质含量增加,寄主植物POD和SOD等保护酶活性增强,以及IAA, SA和JA等植物激素含量提高。现有研究资料显示,致瘿昆虫对寄主植物生理和代谢影响的研究仍处于初级阶段,其影响机制还需要进一步研究。     

气候变化对中国近海8种中上层鱼类潜在生境分布的影响

随着底层和近底层渔业资源的衰退,海洋中上层鱼类在我国海洋捕捞业中逐渐占据重要的地位。预测气候变化情景下中上层经济鱼类的潜在生境分布及其变化规律,可为应对气候变化的鱼类栖息地保护和渔业生态系统管理提供重要科学依据。采用物种分布模型模拟并预测现状及2050年两种气候变化情景下8种中上层经济鱼类在中国近海的潜在分布,通过分布区的收缩-扩张情形和质心迁移距离定量分析气候变化对鱼类空间分布格局的影响。结果表明：(1)模型预测结果良好,各组模型的AUC值均高于0.85,影响目标鱼类潜在分布的主要驱动因子为海水表层温度和溶解氧;(2)8种中上层经济鱼类中,羽鳃鲐(Rastrelliger kanagurta)、鳓鱼(Ilisha elongata)等种类生境分布偏南,气候变化情景下分布北界可扩展至长江口,而鳀鱼(Engraulis japonicus)、青鳞小沙丁鱼(Sardinella zunasi)等种类主要分布在我国北方海域,气候变化情景下生境南缘边界退缩明显;(3)整体来看RCP8.5情景下的空间分布变化率大于RCP2.6情景,其中蓝圆鲹(Decapterus maruadsi)、青鳞小沙丁...     

基于前沿热点案例的合成生物学教学模式的探索与实践北大核心CSCD

作为一门理论性与应用性都很强的课程,“合成生物学”对生物工程领域创新性人才培养发挥着至关重要的作用。为此,华中农业大学开设了“合成生物学”课程。首先,以“重基础知识、抓创新实践、追前沿进展”为理念,通过组建高水平的“合成生物学”教学团队,并不断调整优化课程内容,形成了新颖合理的课程体系。其次,在教学过程中,及时将高水平学术期刊及时事热点新闻报道中有关合成生物学的案例引入课堂教学中,丰富了教学内容,提高了学生的学习兴趣。再次,以前沿热点案例为切入点,通过以“学”为中心的授课模式,引导学生深入探讨,提高了学生的思辨思维与创新能力。本课程取得了很好的教学效果,并有效促进了创新型人才培养,在此与同行交流,以期能为“合成生物学”及相关课程的教学改革提供一些新的启发与思考。     

MicroRNA通路中的关键因子Dicer-1和Argonaute-1对豌豆蚜免疫防御的影响

【目的】研究microRNA(miRNA)通路中两个关键组分Dicer-1和Argonaute-1(Ago-1)在豌豆蚜Acyrthosiphon pisum抵御细菌和真菌侵染中的作用,加深对豌豆蚜免疫防御系统的了解。【方法】用qRT-PCR检测细菌金黄色葡萄球菌Staphylococcus aureus和大肠杆菌Escherichia coli以及真菌球孢白僵菌Beauveria bassiana分别侵染后豌豆蚜成蚜体内Dicer-1和Ago-1的表达量;通过注射法利用RNAi技术对豌豆蚜成蚜Dicer-1和Ago-1进行沉默后,感染金黄色葡萄球菌、大肠杆菌和球孢白僵菌,检测豌豆蚜体内细菌和真菌的增殖和统计豌豆蚜成蚜存活率。【结果】与0.85% NaCl溶液处理的对照组相比,金黄色葡萄球菌、大肠杆菌和球孢白僵菌侵染豌豆蚜成蚜后,其体内Dicer-1和Ago-1的表达量发生了一定程度的上调。RNAi干扰Dicer-1后,感染金黄色葡萄球菌36 h时豌豆蚜成蚜中细菌菌落数显著高于对照组(注射dsLTA)的,但感染后7 d时的存活率与对照组无显著差异;感染大肠杆菌12和24 h时豌豆蚜成蚜体内的细菌菌落数均显著高于对照组的,但感染后7 d时的存活率显著低于对照组的;感染球孢白僵菌后6 d,豌豆蚜成蚜体内真菌孢子数显著高于对照组的,但感染后7 d时的存活率显著低于对照组的。RNAi敲降Ago-1后感染金黄色葡萄球菌,豌豆蚜成蚜体内细菌菌落数在36 h时显著高于对照组的,但感染后7 d时的存活率显著低于对照组的;感染大肠杆菌后,在24 h时豌豆蚜成蚜体内细菌菌落数显著高于对照组的,感染后7 d时的存活率略低于对照组的,但无显著差异;感染球孢白僵菌后6 d,豌豆蚜成蚜体内真菌孢子数显著高于对照组的,但感染后7 d时的存活率显著低于对照组的。【结论】豌豆蚜miRNA通路中的两个关键组分Dicer-1和Ago-1参与了豌豆蚜抵御细菌和真菌侵染的免疫防御反应,尤其在抵御真菌的防御反应中有重要作用。     

二苯乙烯苷抑制NADPH氧化酶对小鼠脑缺血/再灌注损伤的保护作用

目的探讨二苯乙烯苷(TSG)抑制NADPH氧化酶对小鼠脑缺血再灌注(I/R)损伤的保护作用。方法将100只实验小鼠随机分成5组:假手术组、模型组,TSG低剂量组(3 mg/kg),TSG中剂量组(6 mg/kg),TSG高剂量组(12 mg/kg),每组20只。通过双侧颈总动脉结扎造成小鼠脑缺血2 h,再灌注24 h后处死小鼠。采用HE染色法对小鼠脑组织进行病理学检测,采用DHE染色法和ESR波谱仪检测脑组织中活性氧(ROS)水平,采用Western blot法检测脑组织中NOX4和cleaved caspase-3/9蛋白的表达。结果小鼠脑缺血再灌注后,缺血区皮层脑组织出现严重的病理性损伤,其ROS水平显著升高,脑组织中NOX4蛋白表达显著上调,凋亡相关蛋白cleaved caspase-3/9蛋白表达量显著增加。TSG可以显著减轻小鼠缺血再灌注脑组织的病理性损伤,抑制ROS的产生,显著下调氧化应激蛋白NOX4的表达,并显著抑制凋亡相关蛋白cleaved caspase-3/9蛋白的表达。结论 TSG可通过抑制脑组织氧化应激蛋白NOX4的表达,减少活性氧的生成,并抑制凋亡相关蛋白cleaved caspase-3/9过度表达,对小鼠脑缺血再灌注损伤起保护作用。     

短短芽孢杆菌几丁质酶BBChi4基因的原核表达及抑菌活性研究

采用生物信息学方法分析短短芽孢杆菌GZDF3菌株几丁质酶BBChi4基因,以GZDF3菌株全基因组DNA为模版设计特异性引物,通过PCR扩增出BBChi4基因的全序列并对其测序验证。将测序验证无误的基因序列连接到原核表达载体(pET-28a),构建重组表达载体pET-28a-BBchi4,转入大肠杆菌BL21进行诱导表达,利用打孔法对诱导表达产物进行抑菌活性研究。生物信息学分析显示BBChi4基因全长为2 181 bp,编码726个氨基酸,分子量大小为77.69 kD,等电点为4.83,属于酸性几丁质酶。破碎重组表达菌体上清液SDS-PAGE电泳显示,重组蛋白质分子量大约为78 kD,与生物信息学预测结果一致。诱导表达最佳参数为1 mmol/L IPTG,30℃诱导4 h。破碎重组表达菌体上清液对半夏致病真菌(尖孢镰刀菌)有较强的拮抗作用。重组表达载体pET-28a-BBchi4的成功构建及表达为深入研究几丁质酶的功能提供科学依据。