原代小鼠肝脏细胞的高效分离纯化与培养*

摘要目的：建立一种能稳定获得高活力和高纯度原代小鼠肝脏细胞的分离、纯化及培养方法。方法：应用改良的Seglen 二步法原 位灌注和机械离心分离肝脏细胞,并用改良的高糖DMEM培养基进行培养。台盼蓝拒染法检测接种时肝脏细胞的存活率,倒置 显微镜动态观察肝脏细胞形态变化,应用免疫荧光技术对肝脏细胞进行Albumin 染色。结果：每只小鼠可获取肝脏细胞的总产量 平均为1.35× 106 / g体重,肝脏细胞存活率＞ 90%。倒置显微镜下观察贴壁前肝细胞直径为35.14 滋m± 4.35 滋m,肝脏细胞在接种 后3 h基本完成贴壁;肝脏细胞接种后24h,所有肝脏细胞均强阳性表达成熟肝脏细胞标志物Albumin,肝细胞纯度＞ 95%。结 论：改良的分离纯化及培养方法能稳定获得高产量、高活率及高纯度的小鼠肝脏细胞。     

转基因食品安全监测与控制技术

转基因食品从1996年以来已经经历了13年的快速发展,取得了巨大的经济与社会效益。为了确保转基因食品种植和消费,转基因食品安全监测与控制技术领域也取得了长足的进步,形成了一系列的转基因食品环境安全监测与控制技术体系,转基因食品食用安全监测与控制技术体系以及转基因食品分子特征监测与控制技术体系。     

口蹄疫病毒多基因重组质粒在BHK-21细胞中的表达

利用定点突变的原理,获得包含有口蹄疫病毒P1,2A,3C及部分2B编码区的目的基因片段,KpnⅠ和XbaⅠ双酶切后,定向克隆于真核表达质粒载体pcDNA3.1（+）,经筛选、鉴定及DNA序列分析后,将重组质粒pcDNA3.1/P12X3C转染BHK-21细胞,通过双抗体夹心ELISA方法和间接免疫荧光标记方法,检测细胞中表达的口蹄疫病毒抗原。结果表明,口蹄疫病毒基因片段正确克隆到真核表达质粒载体上,重组质粒pcDNA3.1/P12X3C可在BHK-21细胞中表达FMDV目的蛋白。     

中国株HIV-1核心蛋白真核表达载体的构建与表达

运用限制性内切酶XbaⅠ、SalⅠ对pKSGAG进行双酶切,获得HIV-lgag基因,并与真核表达载体pCI—neo连接,构建含有中国流行株HIV-1核心蛋白真核表达载体pCI—neoGAG。经XbaⅠ／SalⅠ双酶切及测序鉴定证实,成功地构建了HIV-1核心蛋白真核表达载体pCI-neoGAG。通过脂质体将pCI—neoGAG转染入p815细胞,G418筛选4周后,使用间接免疫荧光方法检测表达产物。结果表明所构建的HIV-1核心蛋白真核表达载体能在p815细胞中高效表达,为下一步进行HIV-1 DNA疫苗研究奠定了基础。     

复乳法制备红细胞代用品

以单甲氧基聚乙二醇聚乳酸共聚物 [methoxypoly(ethyleneglycol) poly DL lactide,PELA]为膜材 ,用W /O/W的复乳 溶剂扩散法制备了包埋牛血红蛋白 (bovinehemoglobin ,BHb)的微胶囊作为人造红细胞。研究发现复乳过程搅拌分散速率、有机溶剂种类和固化方法对BHb活性有明显影响。当搅拌分散速率小于 90 0 0r/min、以乙酸乙酯为有机相时 ,采用复乳 溶剂扩散法包埋BHb的过程对BHb活性无明显影响。当搅拌分散速率高于 12 0 0 0r/min时 ,BHb活性降低。复乳 溶剂扩散法制备微胶囊过程中固化液体积与微胶囊中BHb活性密切相关 ,通过增大固化液和复乳液的体积比可较好地保持BHb的活性。最后制得了粒径 10 μm左右、包埋率 93%、P50 和Hill系数均接近于天然BHb的微胶囊。     

植物抗寒冻基因工程研究进展

低温寒害是限制农作物产量和分布的一种全球性的自然灾害,提高农作物的抗寒性具有重要意义。目前随着植物寒害机理、抗寒冻和冷驯化分子机理的深入发展,已研究发现了多种抗寒基因,包括各种抗寒调控基因和各种抗寒功能基因,从而使植物抗寒冻基因工程的研究与应用得到了广泛开展,以期最终有效地提高农作物的抗寒性,增加农业产量。本文综合概述了国内外有关植物抗寒冻基因工程的最新研究方向、进展及成就,并提出了此领域尚存在的一些问题及其前景展望。     

枯草芽孢杆菌β-甘露聚糖酶补料发酵及其特性研究

采用正交实验设计对枯草芽孢杆菌产β－甘露聚糖酶的培养基组成和培养条件进行优化,在此基础上进行摇瓶补料发酵,酶活达223．47U／mL,较未补料的酶活提高了32．09％。酶反应最适pH为6．5,最适温度为70℃,该酶在pH5.0-10.0和70摄氏度以下稳定,水解魔芋胶产物主要为二糖以上低聚糖。     

二元酸发酵过程中流加H2O2对细胞色素P450酶及产物生成的影响

在二元酸发酵过程中流加H2O2对热带假丝酵母发酵生产二元酸有明显的促进作用,2mmol/L的H2O2对产酸的促进作用最为明显,比对照提高了26%。对细胞色素P450酶的分析表明,流加H2O2对细胞色素P450酶的活性有明显的促进作用,并且细胞色素P450酶的活性跟产酸成正相关。此外,还进一步分析了流加H2O2对产酸的促进机理。     

猪瘟病毒E2基因主要抗原区的克隆及原核表达

利用反转录PCR（RT-PCR）和套式PCR（nest Polymerase Chain Reaction ,nPCR）技术扩增出当前猪瘟流行毒（广西玉林株,GXYL）与中国猪瘟兔化弱毒（C-株）兔脾组织毒E₂基因的主要抗原区,将其克隆到表达载体pP_ROEX-HTb中,获得重组质粒pP_ROEX-GXYL和pP_ROEX-C,经PCR、酶切和序列分析鉴定表明,插入的位置、大小和读码框均正确。 SDS-PAGE检测表明,经重组质粒pP_ROEX-GXYL和pP_ROEX-C转化、诱导的受体菌能表达E₂基因主要抗原区蛋白,Western-blot检测表明,诱导表达的抗原蛋白能与猪瘟阳性血清发生特异性反应。      

金霉素单克隆抗体的制备及检测方法的建立

采用羰基二咪唑法,将半抗原金霉素(AM)分别与牛血清白蛋白(BSA)和卵清蛋白(OVA)偶联制备金霉素免疫抗原AM-BSA和检测抗原AM-OVA,通过紫外光谱扫描检测偶联产物。采用细胞杂交瘤技术,制备抗金霉素单克隆抗体杂交瘤细胞株,建立了金霉素竞争ELISA检测方法,其灵敏度达到50ng/ml,且呈现良好的线性关系(r=0.9812),并且与其他抗生素无交叉反应。