PCR快速鉴定鼠疫耶尔森氏菌

建立一种简便、快速、特异的PCR检测方法,用于鼠疫耶尔森氏菌的快速鉴定。针对鼠疫耶尔森氏菌特异的一段染色体序列3a设计引物,扩增-276bp片段的鼠疫标识序列。应用该PCR反应体系,对我国17个生态型及1个待定的生态型共计275株鼠疫耶尔森氏菌及48株相关菌株的PCR扩增结果表明,实验菌株均扩增出预期的276bp片段产物带,48株相关菌株均阴性,其检测灵敏度为100pg DNA。说明该方法用于鼠疫耶尔森氏菌的检测鉴定简便、快捷,具有很高的特异性和敏感性。     

应用TaqMan荧光定量PCR检测土拉弗朗西斯菌

目的：利用Roche LightCycler实时定量PCR系统建立一种快速、灵敏、特异的检测土拉弗朗西斯菌的方法。方法：基于TaqMan荧光探针实时定量PCR技术,选择土拉弗朗西斯菌染色体上的特异序列[醇醛酮还原酶（AKR）和外膜蛋白FopA基因]作为检测靶序列,建立土拉弗朗西斯菌实时定量PCR检测方法;评价该检测方法的特异性和灵敏性;采用克隆菌株污染环境土壤来模拟实际样品,评价该检测方法在快速检测与现场检测等实际应用中的表现。结果：优化筛选基因组中的FT-AKR和FT-fopA片段作为检测靶序列,所建立的土拉弗朗西斯菌实时定量PCR检测方法检测克隆菌株质粒的灵敏度均为10个拷贝/每个反应体系;以其他非土拉弗朗西斯菌为模板未出现非特异扩增;模拟环境土壤样品检测灵敏度2个引物对分别为440和960CFU/g土壤;盲测实验结果显示对于灵敏度范围内的阳性样本均能正确识别,并能正确检测出不同浓度的阳性样本。以FT-fopA片段为靶序列的扩增效率不及基于FT-AKR引物对的扩增。结论：基于FT-AKR片段的引物对扩增效率高,检测土拉弗朗西斯菌具有特异、灵敏的特点,对临床诊断、环境污染监测、防治生物突发事件等具有重要意义。     

基于rV270抗原的鼠疫多孔微球疫苗的制备及其免疫保护作用评价

目的：评价生物可降解高分子材料多孔微球作为鼠疫亚单位疫苗佐剂的可行性。方法：制备可生物降解的高分子材料多孔微球,将rV270抗原蛋白吸附到多孔微球中制备微球疫苗,肌肉注射免疫BALB/c小鼠,初次免疫后21d加强免疫1次,于初次免疫后第10周用600LD50鼠疫耶尔森氏菌攻毒,攻毒后观察14d。结果：攻毒后,微球疫苗免疫的小鼠全部存活,且健康状况良好,对照组小鼠几乎全部死亡。结论：生物可降解多孔微球可作为免疫佐剂用于鼠疫亚单位疫苗研制。     

IS1OO周围序列多态性分析技术的建立及其在鼠疫耶尔森氏菌分型中的应用

建立鼠疫耶尔森氏菌IS1000周围序列多态性（ISCP）分析技术,并探讨其在鼠疫耶尔森氏菌分型中的应用,根据鼠疫杆菌CO92株IS100的基因序列在其两端设计两条向外延伸的引物进行PCR扩增,电泳,获得的指纹图用RAPD,PHYLIP和Treeview软件分析,建立的ISCP分析技术稳定,可靠,利用该技术分析17个生态型的271株鼠疫耶尔森氏菌,扩增结果表明,指纹图有一定的差异,经RAPD,PHYLIP和Treeview分析可分为3个类型,IS100在鼠疫耶尔森氏菌染色体中虽然分布较广,但其周围序列变异较小,在遗传上较稳定,可作为鼠疫耶尔森氏菌的基因标志,研究该菌的分型与进化。     

用热变性温度法测定五个细菌新种DNA的GC含量

利用林万明等建立的实验方法测定了五个细菌新种DNA的GC含量,同时对未见报道GC含量的两种细菌进行了测定,现将结果报告如下。     

PCR鉴定肺炎克雷伯菌的强毒性血清型

目的:了解肺炎克雷伯菌强毒性血清型K1、K2、K54和K57型菌株在我国重庆、北京、深圳三地的分布及流行趋势。方法:采用PCR对310株肺炎克雷伯菌临床分离株进行血清型K1、K2、K54和K57检测。结果:310株菌中,K1、K2、K54和K57血清型分别占14.2%、9.4%、6.5%和4.2%;来自呼吸系统标本分离株中的K1血清型菌株在4种检测的强毒血清型中占首位,为呼吸系统总数的17.4%。结论:310株肺炎克雷伯菌的4种强毒性血清型中,K1血清型菌株所占比例高,较为流行。     

鼠疫菌重要调控子蛋白的表达纯化及DNA结合活性分析

目的:利用大肠杆菌BL21(λDE3)的表达系统,表达7个有活性的、与鼠疫耶尔森菌(鼠疫菌)传播及致病密切相关的调控子蛋白,并对这些蛋白与DNA的结合活性进行分析,为构建鼠疫菌毒力基因转录调控网络建立分子生化实验平台。方法:通过分子克隆技术构建鼠疫菌调控子蛋白的表达菌株,所得菌株经IPTG诱导后能分别表达鼠疫菌CRP、Fur、PhoP、OxyR、OmpR、RcsB和RovA带His标签的融合蛋白;对这些蛋白与DNA的结合基序进行生物信息学预测;通过体外凝胶迁移实验验证上述蛋白与靶DNA的结合活性。结果:表达了7种有活性的鼠疫菌调控子蛋白,这些蛋白与靶基因启动子区具有体外结合活性。结论:表达的7种调控子蛋白在鼠疫菌的传播致病中有重要作用,这些调控子蛋白与DNA体外结合实验平台的建立,是构建鼠疫菌毒力基因转录调控网络的基础。     

C型凝集素LSECtin识别细菌的研究

目的:通过sLSECtin-Fc蛋白与细菌及细胞的黏附,寻找能与LSECtin结合的细菌。方法:通过ELISA检测sLSECtin-Fc与细菌的黏附,同时构建CHO-pDsRed1-N1-LSECtin稳定细胞株进行与细菌的黏附实验,荧光显微镜进行镜鉴拍照。结果:获得能够与sLSECtin-Fc蛋白黏附的细菌,并且通过过表达LSECtin的稳定株与细菌的黏附,发现LSECtin可以结合大肠杆菌和肺炎链球菌,而不能结合金黄色葡萄球菌和肺炎克雷伯杆菌。结论:发现LSECtin可以结合细菌,为进一步研究LSECtin在先天免疫中的作用奠定了基础。     

鼠疫菌H-NS蛋白的表达与纯化及其DNA结合活性

摘要：【目的】利用大肠杆菌BL21λDE3的表达系统,表达出有活性的鼠疫耶尔森氏菌（以下简称鼠疫菌）调控子蛋白H-NS,为进一步研究H-NS的转录调控奠定基础。【方法】 PCR扩增鼠疫菌201株hns基因的编码区,将其直接克隆入pET28a质粒中,再将pET28a-hns重组质粒转入大肠杆菌BL21λDE3菌株中,所得菌株经IPTG诱导后能表达出鼠疫菌His-H-NS蛋白;通过体外的凝胶迁移实验（EMSA）和DNaseⅠ足迹实验对His-H-NS蛋白与DNA的结合活性进行分析。【结果】成功表达出有活性的鼠疫菌His-H-NS蛋白,该蛋白对鼠疫菌pH6抗原基因（psaA、psaE）及rovA基因均有结合活性。【结论】鼠疫菌His-H-NS具有DNA结合活性,说明H-NS能调控鼠疫菌基因的转录。     

从土壤中提取细菌和芽孢核酸用于PCR的研究

本文探讨了土壤中提了细菌及其芽孢DNA用于PCR扩增检测的方法,我们采用的碘化钠裂解,玻璃粉吸附方法,可以有效提取和纯化土壤中的细菌及芽孢的核酸,操作简便,不需要特殊设备,提取的核酸可直 用于PCR扩增反应,我们用炭疽芽孢杆菌A16R疫苗株的芽孢的类鼻疽伯克霍尔德氏菌污染土壤,使用这一方法从中提取核酸,并用于PCR扩增,证实了该方法的实用性。