三重RT-PCR同步检测马铃薯多种病毒影响因素

根据病毒外壳蛋白区序列设计PVX、PVS特异性引物对,根据P1基因区序列设计PVA特异性引物对,应用三重RT-PCR同步检测马铃薯X病毒,马铃薯A病毒及马铃薯S病毒,分别得到562bp、255bp、182bp大小的扩增片段。试验从反转录反应、PCR反应及循环条件3方面讨论了试剂和循环条件对三重RT-PCR同步检测3种病毒的影响。结果表明反转录反应中dNTPs浓度、3种病毒下游引物浓度比例对整个反应影响较大;其次是PCR反应中MgC12浓度和退火温度;反转录时间,循环条件对RT-PCR影响较小。     

一种核糖体展示单链抗体文库的构建与鉴定

用柑桔溃疡病致病菌Xanthomonas axonopodis pv. citri（Xac）全菌免疫小鼠,提取小鼠脾细胞mRNA,RT-PCR扩增小鼠抗体重链可变区（VH）和轻链可变区（VL）,采用linker (Gly4Ser)3连接VH和VL,构建用于核糖体展示方法筛选阳性单链抗体（scFvs）的文库。通过将scFv文库DNA转化大肠杆菌JM109,随机挑取克隆子测序以分析单链抗体文库的多样性。结果显示,用柑桔溃疡病菌免疫后的小鼠抗血清效价为2500倍左右,扩增的VH大小为350bp左右,VL的大小为650bp左右,linker连接后的单链抗体文库DNA大小为1200bp左右。测序结果显示,单链抗体文库多样性好。以Xac为靶,筛选到了抗Xac的特异性抗体,说明该抗体库可用于柑桔溃疡病菌单链抗体的筛选。     

延迟5分钟剖宫产造全脑缺氧缺血新生大鼠模型

目的建立围产期全脑缺氧缺血性损伤的新生大鼠模型。方法 SD雌性大鼠妊娠21 d时,颈椎脱臼法处死,用止血钳夹闭双侧子宫角血管5 min后,剖宫产取出新生大鼠,交由代乳鼠喂养。结果造模组雌性大鼠9只,共娩出新生大鼠91只,出生3 d内死亡7只,死亡率7.7%。新生大鼠出生第2天进行翻身实验,第14天进行悬吊实验和斜坡实验,造模组和其余各组均有显著性差异。新生大鼠出生后21 d,取脑组织切片行HE染色,显示大脑皮层典型的缺氧缺血性损伤,与正常组相比,可见神经细胞明显的病理形态学改变。结论采用延迟5min剖宫产和代乳鼠喂养的方法,操作简便,并结合行为学测试筛选行为异常者,可建立稳定可靠、可供长期实验使用的围产期全脑缺氧缺血性损伤的新生大鼠模型。     

小麦矮腥黑穗菌差异片段筛选与分子检测体系的建立

采取随机扩增DNA多态性(Random amplified polymorphic DNA,RAPD)引物介导的半特异PCR技术(RAPD primer mediated hemi-specific PCR,RM-PCR),在从不同地域征集的18个小麦矮腥黑穗菌(Tilletia controversa Kühn,TCK)菌株和29个小麦网腥黑穗病菌(Tilletia caries(DC)Tul,TCT)菌株的总基因组DNA中筛选鉴定出TCK独有的大小为1322bp差异基因组片段。根据该片段序列设计筛选出2对特异性引物CQUTCK2/CQUTCK3和CQUTCK4/CQUTCK5,均可以从18个TCK菌株的菌丝体和冬孢子DNA中稳定地扩增出747bp和200bp的单一靶带DNA,而在29个TCT菌株的菌丝体或冬孢子DNA均无任何扩增产物。以腥黑穗菌属通用引物对CQUK6/CQUK7为内置对照,可以确定被检样品是否含PCR抑制物质进而判断检测体系是否正确,同时有效地排除样品检测结果的假阳性和假阴性。采用建立的TCK特异PCR检测技术体系,实现简单而快速地鉴定小麦矮腥黑穗菌冬孢子或罹病小麦组织中侵染菌丝体的目的。     

文库筛选与分子进化的核糖体展示新方法

利用适当的文库筛选技术快速、简便地从DNA文库、随机肽库、抗体库或其它蛋白文库中筛选生物活性物质是目前分子生物学研究的一个热点.核糖体展示是一种完全离体进行的功能蛋白筛选和进化鉴定的新技术,避免了传统的活体筛选技术的缺陷,使得文库容量增大、分子多样性加强.本文系统地评述了核糖体展示技术在制备ScFv单链抗体方面的应用,包括ScFv单链抗体模板的构建、体外转录与体外翻译、亲和筛选及筛选效率的测定以及分子多样性和体外进化研究,讨论了核糖体展示技术目前的发展动态、存在问题及发展趋势.     

食管癌切除术患者运动能力、肌肉力量和生活质量的相关性分析

摘要 目的：探讨食管癌患者术前功能锻炼能力、肌力、焦虑、抑郁和健康相关生活质量（QOL）的特点,并评估食管癌根治术对这些参数的影响。方法：我们对2019年1-12月36例新诊断的可切除食管癌患者进行回顾性分析,这些患者接受了食管切除术并进行了术后康复治疗。术前、术后2周分别进行6 min步行距离（6MWD）、膝伸肌肌力、握力、医院焦虑抑郁量表（HADS）和慢性阻塞性肺疾病（COPD）评定量表（CAT）测试。术前进行肺功能测试,并对MOS 36项目健康问卷（SF-36）的组成部分进行一般健康评定。结果：患者平均年龄66.1±9.2岁。患者以男性为主（75.0%）,有较高的吸烟史（80.6%）,鳞状细胞癌（94.4%）。COPD 15例。临床分期：0-I期11例,II期6例,III期15例,IV期4例。29例行开腹手术。SF-36评分的组成部分与CAT和HADS评分显著相关,COPD患者的身体状况明显差于非COPD患者（P<0.05）。比较术前和术后的数值,发现术后6MWD、握力、等长膝伸肌肌力显著降低,CAT评分显著升高（P<0.05）,HADS评分无明显升高（P>0.05）。在多元回归分析中,术后6MWD的下降与术前SF-36的生理成分总结显著相关。结论：从微创手术和围手术期处理的角度来看,有必要进一步改进围手术期的康复。在手术后两周,食管切除术对健康相关的QOL和身体健康有害,需建立围手术期康复策略,以改善术后结果。     

贡嘎蝠蛾幼虫肠道真菌多样性分析

[目的]分析贡嘎蝠蛾肠道(Hepialus gonggaensis)幼虫肠道真菌多样性.[方法]采用常规分离与分子鉴定的方法和基于ITS(internal transcribed spacer)基因的RFLP方法,建立贡嘎蝠蛾幼虫肠道真菌的ITS克隆文库,分别用MspⅠ、HaeⅢ和Taq Ⅰ对205个阳性克隆的质粒酶切指纹图谱分析,结果显示有23个不同的RFLP操作分类单元(OTU),对这23个操作分类单元的阳性克隆子进行测序并绘制系统进化树.[结果]结果显示贡嘎蝠蛾幼虫肠道内存在8个属的真菌类群.其中被孢霉属(Mortierella)和丝孢酵母属(Trichosporon)的丰度最高,分别占克隆文库的46.34%和40.00%,鉴定为肠道内的优势真菌类群.用常规分离与分子鉴定方法只获得隐球酵母(Cryptococcus magnus)、Geomyces sp和丝孢酵母(Trichosporon porosum)3个类群的真菌.结合常规分离法与RFLP法能够更有效的分析肠道微生物的多样性,获得更多更全面的微生物多样性信息.     

一种适合于马铃薯病毒ssRNA快速提取技术

针对马铃薯病毒ssRNA制样过程中产生色素、多酚物质抑制RT PCR反应的问题 ,通过确定多酚氧化酶抑制剂Na2 SO3 的最适浓度 ,筛选核酸快速浸提的表面活性剂 ,研制出马铃薯病毒简易浸提制样技术 ,可以从植物组织中快速释放ssRNA并减少PCR反应抑制物质的析出。此法简便有效 ,可以从马铃薯叶片 ,叶柄 ,茎和块茎中快速提取PVY、PVX ,PLRV、PVA、PVS等多种马铃薯病毒ssRNA ,适合于同步验证马铃薯原原种和原种的脱毒效果以及田间疑似病症的快速诊断和不同马铃薯病毒的准确鉴定。