抗菌肽Cec4的结构改造及抗菌活性研究

[目的]对抗菌肽Cec4进行结构改造,并评估优化小肽的稳定性及溶血性。[方法]采用序列截短、氨基酸替换的方式来改造Cec4。采用微量稀释法,检测改造后的Cec4对各类鲍曼不动杆菌、肺炎克雷伯菌的最小抑菌浓度(MIC)。绘制时间-杀菌曲线,并评估不同因素对抗菌肽抑菌活性的影响,最后通过溶血实验检测其安全性。[结果]①截短后的Cec4失去抑菌效果。②Cec4氨基酸替换后的Cec4-1、Cec4-2未能提升抑菌能力。Cec4-4的MIC值为Cec4的50%。③在24h,时间-杀菌曲线显示,Cec4-4的抑菌活性较Cec4高30%。④血清会影响抗菌肽活性,并且高浓度胰蛋白酶(1. 0 mg/m L)会抑制Cec4-4抗菌活性。⑤溶血实验表明Cec4-4在1 mg/m L浓度下无溶血反应。[结论]截短使Cec4失去抑菌活性,氨基酸替换后的Cec4-4对各测试菌的抑菌活性较母肽提升了1倍,且抗菌肽在1mg/m L浓度下对人体无溶血反应。     

不同载体表达的家蝇β-葡萄糖苷酶生物学活性比较

克隆家蝇内源性β-葡萄糖苷酶(beta-glucosidase,BG)基因,建立两种原核表达体系和一种真核表达体系,分别检测表达产物的活性,比较不同表达体系对其表达水平及重组蛋白酶学性质的影响,为进一步研究和利用家蝇BG酶奠定基础。本研究根据BG酶基因的cDNA序列设计引物扩增BG酶基因成熟肽的基因片段,分别采用表达载体pET-28a(+)和pEGX-4T-1构建原核表达体系并在大肠杆菌BL21(DE3)中诱导表达。在65 kDa附近均出现特异性蛋白条带,进行Western Blotting鉴定证实重组质粒在其宿主菌E.coli BL21(DE3)中成功表达,命名为MDBG-1蛋白和MDBG-2蛋白。同时选用真核表达载体pPICZa A构建酵母分泌型表达体系在酵母细胞GS115中获得稳定的表达,将其命名为MDBG-3蛋白。采用七叶苷平板法和DNS法对三种表达体系所重组表达的蛋白进行酶活性鉴定和检测,显示3种表达体系所表达的融合蛋白均具有BG酶活性,其酶活力有所不同,且真核表达体系所表达的蛋白酶活性最高。本研究对家蝇β-葡萄糖苷酶基因表达的重组蛋白特性进行初步研究,为发现新的有效纤维素酶体系提供基础数据。     

家蝇丝氨酸蛋白酶抑制剂Serpin15的克隆表达及重组蛋白的体外活性分析

为探明家蝇重组Serpin15蛋白的体外活性和酶稳定性,本文对家蝇Serpin15基因进行了生物信息学分析和克隆表达,并对纯化后的家蝇重组Serpin15蛋白进行了酶特性的研究.结果显示:家蝇Serpin15基因ORF框全长为1353 bp,编码450个氨基酸,理论分子量为51076.63 Da,有信号肽和一个标志抑制活性的功能结构域RCL反应环;成功构建原核表达载体pET-28a(+)-Serpin15,经诱导表达和纯化获得家蝇重组Serpin15蛋白;重组蛋白酶特性研究发现,家蝇重组Serpin15蛋白对胰蛋白酶有极显著的抑制作用,此外,将重组Serpin15蛋白经20～60℃热处理15 min,或经pH 6～10过夜处理,或经50℃和pH 8处理后室温存放15～90 min,重组蛋白的胰蛋白酶抑制活性均仍大于70％.研究结果为家蝇Serpin15蛋白的免疫功能研究奠定了重要实验基础,也为有害昆虫杀虫剂的研发提供思路.     

应用iTRAQ标记技术结合2DLC-MS/MS分析家蝇幼虫免疫诱导后血淋巴蛋白质组

目的分析家蝇幼虫免疫诱导前后血淋巴中的免疫防御相关靶标,探索其先天性免疫机制。方法采用同位素标记及相对定量技术(isobaric tags for relative and absolute quantification,iTRAQ)结合2D LC-MS/MS对家蝇幼虫诱导前后的血淋巴蛋白质组进行研究。结果与对照组比较研究后共获得237个不同肽段,鉴定到13个具有定量信息的差异蛋白。免疫刺激后显著上调的蛋白有9个,下调蛋白4个(P0.05),对鉴定到的差异蛋白进行理化性质分析和GO(gene ontology)注释分析,发现这些蛋白分别具有抗菌、抗氧化、催化结合等功能,并参与了免疫、代谢、应激、转运等生物学过程,表明对家蝇幼虫经诱导后血淋巴中多种功能蛋白的表达发生了变化。结论 iTRAQ标记技术结合2D LC-MS/MS可以有效地分离鉴定昆虫血淋巴蛋白质组,为深入研究差异蛋白的功能奠定了基础。     

家蝇β-葡萄糖苷酶基因的克隆及重组表达

克隆家蝇内源性β-葡萄糖苷酶(beta-glucosidase,BG)基因并建立原核表达体系,检测其表达产物的活性,了解家蝇内源性BG酶特点,为进一步解释家蝇极强环境适应能力和发现新的种群控制措施提供分子生物学基础。以草地贪夜蛾等结构信息相对完整且研究较为透彻的6种代表性昆虫的BG酶基因序列为参照对象,利用同源克隆结合RACE-PCR的方法,从家蝇cDNA中克隆得到BG酶基因的全长cDNA序列并对其进行生物信息学分析。分别采用原核表达载体pET-28a(+)构建原核表达体系并在大肠杆菌E.coli BL21(DE3)中诱导表达BG酶基因的融合蛋白。采用七叶苷平板显色法和DNS法检测表达体系融合蛋白的酶活性,并对其性质进行初步的分析。家蝇体内克隆得到了长度为1933 bp的家蝇BG酶基因全长cDNA序列,推导其为562个氨基酸残基组成的蛋白多肽。重组原核质粒经诱导表达后,在65 kDa附近均出现特异性蛋白条带,证实重组质粒成功表达。重组表达的家蝇BG酶兼具内切β-1,4-葡聚糖酶、外切β-1,4-葡聚糖酶和BG的酶活性。家蝇BG酶是一种新的多功能纤维素酶,是昆虫纤维素酶研究的重要补充。     

家蝇幼虫分泌物抗菌肽的生化特性初步研究

研究了不同温度、蛋白酶及反复冻溶对家蝇 Musca domestica 幼虫活体浸泡法获得的分泌物抗菌肽抗菌活性的影响;并检测其凝血效应;试管稀释法测定其最低抑菌浓度（MIC）、最低杀菌浓度（MBC）;SDS-PAGE分析其分子量范围。结果表明,该抗菌肽具有较强的热稳定性、酶稳定性及较强抗菌活性的特性,无凝血作用。对大肠埃希菌的最低抑菌浓度为37 μg/mL、最低杀菌浓度为75 μg/mL;分子量约10 kD。