黑曲霉变异株UV-11-48的选育及产糖化酶条件的研究

以黑曲霉(Aspergillus niger)变异株UV-11为出发菌株,经亚硝基胍多次诱变,获得一株比亲株产糖化酶活力提高30%左右的变异株UV-11-48。对UV-11-48菌株进行了发酵条件及酶系组成等的研究。固体曲生产性试验,种曲糖化酶活力最高达12240u/g,麸曲酶活力平均8000—9000u/g,最高达11700u/g,在酿酒工业固体曲生产中,取得明显经济效益。     

黑曲霉糖化酶高产菌株的糖化酶结构基因的分离及其序列分析

从糖化酶高产菌株(Aspergills niger)T21中分离出染色体DNA.Southern印跡分析表明糖化酶结构基因位于约2.5kb的EcoRⅠ-EcoRV片段中.该染色体DNA经EcorⅠ、EcoRⅤ完全酶切后,用琼脂糖凝胶电泳分离,回收2.0—3.0kb的片段,与载体pBR322连接后转化宿主菌大肠杆菌DH5,获得转化子.通过原位杂交,从转化子中筛选出4个阳性克隆.阳性克隆的进一步酶切鉴定及序列分析表明,黑曲霉T21糖化酶结构基因大小为2.3kb,含有4个内含子.     

矿油封藏法保存子囊菌的效果

用矿油(液体石蜡)封藏法保存子囊菌,10年后,经测定在26属55种292株中,存活20属47种227株,存活率78%。结果表明,此法对侵管新赤壳(Neocosmospora vasinfecta)、光亮卷钩丝壳     

葡萄糖氧化酶法测定糖化酶活力

糖化酶也叫葡萄糖淀粉酶(glucoamylase),是应用于葡萄糖、酒精等生产的一种工业用酶。测定糖化酶活力是以在一定条件下作用于可溶性淀粉后生成的葡萄糖的毫克数来表示的。但在实际测定时,一般都采用斐林法和次亚碘酸盐法等定量测定还原糖总量的方法。我们在糖化酶研究工作中发现,用上述方法能比较准确     

烟曲霉蛋白质分泌载体的构建及酸性磷酸酯酶的细胞定位

[目的]在酵母细胞中蛋白质的糖基磷酸肌醇化(GPI)修饰是将GPI定位于细胞膜或细胞壁的信号.目前已对酵母GPI蛋白的细胞定位信号有一定了解,但对丝状真菌GPI蛋白的定位则了解甚少.AfPhoA是丝状真菌烟曲霉(Aspergillus fumigatus)的酸性磷酸酯酶,是GPI修饰的蛋白.该蛋白首先分离自细胞膜,随后又发现该蛋白与细胞壁结合.分析其C-端序列也未发现已知的定位信号,因此目前还不能确定其细胞定位.[方法]我们以绿色荧光蛋白(GFP)作为报告分子,将AfPhoA的C-端序列与GFP的C-端融合后检测融合GFP的细胞定位.[结果]我们用烟曲霉几丁质酶AfChiB1的启动子和N-端信号肽构建了可在烟曲霉中分泌表达GFP的表达载体pchiGFP.在此基础上将AfPhoA的C-端与GFP融合,融合质粒与pCDA14共转化烟曲霉后筛选到一株转化子.该转化子可表达融合GFP,在诱导和非诱导条件下,融合GFP均主要分布在细胞膜上,随培养时间的延长,融合GFP在细胞壁上也有少量分布;在培养上清液中只能检出约30KD的GFP融合蛋白,而没有完整的GFP融合蛋白,推测为从GPI锚上水解释放的.[结论]我们的研究结果表明,AfPhoA蛋白GPI修饰的作用是使该蛋白定位于细胞膜.本研究不仅初步确定了AfPhoA蛋白GPI修饰的细胞膜定位功能,而且为烟曲霉基因与蛋白质功能的研究建立了一个有效表达系统.     

瑞氏木霉内切葡聚糖酶基因在工业啤酒酵母中的整合和表达

用PCR合成的瑞氏木霉（T.reesei）β-内切葡聚糖酶Ⅰ（EGⅠ）的cDNA, 构建了由酵母醇脱氢酶 （ADH1）启动子和终止子引导表达、β-内切葡聚糖酶自身信号肽序列引导分泌、由酵母rDNA序列引导同源整合的酵母YIP型β-内切葡聚糖酶表达分泌质粒pA15PET。采用pA15PET与酵母YEP型G418抗性表达质粒的共转化,将EGⅠ表达单元整合到已整合有α-乙酰乳酸脱羧酶（α-ALDC）表达单元的啤酒酵母工程菌BE9711的染色体rDNA序列中,获得同时表达胞内α-ALDC和胞外β-内切葡聚糖酶的啤酒酵母工程菌。     

黑曲霉T21 glaA 5′上游调控区DNA与蛋白因子的相互作用分析

以糖化酶生产菌株黑曲霉T21(Aspergillus niger T21)的糖化酶基因(glaA)5′cis调控区片段为探针, 采用电泳迁移率变动分析(EMSA)法,从黑曲霉蛋白粗提液中检测到与glaA 5′调控区特异结合的蛋白因子,并把其结合DNA定位在T21 glaA 5′调控区的-374~ -344,-484~-414以及-580~-540 bp 3个区段, 且此3个结合DNA的片段在EMSA实验中呈现交叉竞争, 表明这3个DNA区段可与同一个蛋白因子相结合. 以-374~-344 bp序列为探针的紫外交联实验表明, 该蛋白因子的分子量(或亚基分子量)约为10 ku. 利用DNaseⅠ足印分析确定了此蛋白因子在前两个区段的精细结合部位, 并对其结合序列的特性进行了分析.     

红曲AS 3．3491葡萄糖淀粉酶生物合成的调节

红曲 Monascus AS 3.978的变异株 AS 3.3491曾是葡萄糖淀粉酶的工业生产菌株。本文报告的实验结果表明该菌株的葡萄糖淀粉酶是构成酶,它的形成受降解物阻遏的调控。AS 3.3491葡萄糖淀粉酶形成的时间过程属典型的产物形成与生长呈负相关的类型,即菌丝体生长停止后酶才开始大量形成。从培养基中除去过量易利用碳源可使葡萄糖淀粉酶形成消阻遏。各种可利用碳源以低浓度分别加到洗涤的菌丝体悬浮液中都能促进葡萄糖淀粉酶的形成,其中蜜二糖和半乳糖的促进作用最甚。在限制生长的条件下,即向洗涤菌丝悬浮液连续缓慢供给低浓度葡萄糖,则在整个培养过程中,葡萄糖淀粉酶的活力稳步上升,不需要任何诱导物,并且比酶形成值达到蜜二糖培养基的水平。因此,高浓度葡萄糖阻遏葡萄糖淀粉酶形成,但低浓度葡萄糖却促进酶的形成。