用构建的新型BmNPV载体在家蚕高效表达人β-干扰素

家蚕核多角体病毒(Bombyx mori Nuclear Polyhedrosis Virus.BmNPV)和家蚕细胞已成功地用来大量生产具有生物活性的重组蛋白。但是BmNPV的通用载体的类型较少。因此,本实验构建了BmNPV新型载体pBm92,该载体将多角体蛋白基因的起始密码ATG改变为ATT,然后在多角体蛋白基因的 12位外连接有5个外源基因的克隆位点。将HuIFN-β基因克隆在多角体蛋白基因的 12位后,构建了pBmIFN 12;同时构建HuIFN-β克隆在-3位后的转移栽体pBmIFN-3。将两种转移载体DNA分别与BmNPV基因组DNA共转染Bm-N细胞。利用重组病毒不产生多角体蛋白的特征,筛选重组病毒。用HuIFN-β基因探针与重组病毒DNA进行杂交鉴定。重组病毒BmIFN 12感染Bm-N细胞,其上清IFN活性最高时可达2.0×10~6IU/ml,将BmIFN 12注射5龄家蚕虫体,表达水平为50×10~7IU/ml,是HuIFN-β基因克隆在多角体蛋白基因的-3位后获得的重组病毒的表达量的2～4倍。家蚕体生产的rHulFN-β为糖基化蛋白具有天然HuIFN-β的抗原性。     

肺表面活性物质治疗新生儿呼吸窘迫综合征前给予nCPAP呼吸支持最佳时间窗的临床研究

摘要 目的：探讨肺表面活性物质（PS）治疗新生儿呼吸窘迫综合征（NRDS）前给予经鼻持续气道正压通气（nCPAP）呼吸支持的最佳时间窗。方法：选择2017年1月至2019年12月期间我院收治的NRDS患儿100例。根据随机数字表法分为A组（给予PS前预先进行小于2 h的nCPAP,n=33）、B组（给予PS前预先进行2-4 h的nCPAP,n=33）和C组（立即给予PS,n=34）。对比三组患儿的血气分析指标、肺功能指标、临床指标和并发症发生率。结果：A组、B组给予PS后4h、给予PS后24 h动脉血氧分压（PaO₂）、pH值高于C组,且B组高于A组（P<0.05）,而动脉二氧化碳分压（PaCO₂）低于C组,且B组低于A组（P<0.05）。A组、B组给予PS后4 h、给予PS后24 h潮气量（VT）、肺动态顺应性（CD）高于C组,且B组高于A组（P<0.05）,而吸气阻力（Raw）低于C组,且B组低于A组（P<0.05）。B组用药后3天内需气管插管行机械通气例数少于A组和C组,住院时间短于A组和C组（P<0.05）,A组、C组的用药后3天内需气管插管行机械通气例数、住院时间对比无明显差异（P>0.05）。三组患儿并发症发生率未见统计学差异（P>0.05）。结论：给予PS前预先进行2-4h的nCPAP,可较好地改善患儿血气分析指标和肺功能,有助于改善患儿预后。     

局灶缺血性脑卒中大鼠侧脑室下带Shh信号通路成分的动态表达

通过研究Sonic hedgehog(Shh)信号通路成分在局灶缺血性脑卒中大鼠侧脑室下带(subventricular zone,SVZ)的动态表达,初步探讨该通路在局灶性缺血性脑卒中后神经再生的调控作用.将84只健康成年雄性SD大鼠随机分为正常组(n=12)、假手术组(n=12)、缺血6、12、24 h和3、7 d,共7组(n=12).采用线栓法制备大鼠右侧大脑中动脉阻断(middle cerebral artery occlussion,MCAO)模型.分别应用逆转录聚合酶链反应(RT-PCR)、免疫组化、免疫印迹法检测局灶脑缺血大鼠侧脑室下带Shh、Gli1 mRNA和蛋白变化.与正常组比较,Shh、Gli1mRNA和蛋白在假手术组表达变化不明显(P>0.05),模型组6 h表达增高(P<0.01),24 h达峰值(P<0.01),3 d时接近正常水平(P>0.05),7 d表达又升高(P<0.01).缺血性脑卒中可以上调Shh信号通路成分在SVZ区的表达,提示Shh信号通路可能参与卒中后神经再生机制的调控.     

种植年限对蔬菜日光温室土壤微生物区系和酶活性的影响

以种植2、4、6、11、13、16、19年的蔬菜日光温室土壤为研究对象,并以露地菜田为对照,测定了土壤微生物区系及酶活性的变化.结果表明: 随着种植年限的增加,土壤中细菌、放线菌和微生物总数均呈现先增加后减少的趋势,在种植11年时达到最大值,分别比对照增加了54.8%、63.7%和55.4%,差异达显著水平;而真菌数量持续上升,种植19年约为对照的2.2倍.微生物生理类群中,纤维素分解菌、自生固氮菌、亚硝酸细菌、反硝化细菌和硫化细菌数量的变化趋势与细菌相似, 种植11年分别为对照的1.5、1.6、1.9、1.4和1.1倍;而氨化细菌数量则呈现先减少后增加的趋势,在种植13年时达到最小值,为对照的56.0%.土壤中脲酶、多酚氧化酶、蔗糖酶、蛋白酶、纤维素酶和碱性磷酸酶活性随种植年限的增加呈现先增强后减弱的趋势,而过氧化氢酶活性较稳定.相关分析表明,细菌、放线菌和微生物总数与各土壤酶均呈显著正相关;而真菌数量与脲酶、蔗糖酶、过氧化氢酶和碱性磷酸酶均呈负相关,其中与过氧化氢酶的相关性达到显著水平.     

云南盘鮈不同地理居群的形态变异及分化

将采自中国元江、南盘江和金沙江水系的233尾云南盘鮈和短鳔盘鮈鱼类标本,按采集点地理位置就近的原则归类分为11个组,共测量了21个框架结构性状和22个常规性状。应用多变量形态度量学方法比较云南盘鮈各地理居群间的形态差异;并期望补充云南盘鮈与短鳔盘鮈的形态学鉴别特征。主成分分析结果表明,全部标本聚集在一起没有分离。差异系数分析结果表明,金沙江组内、元江组内及短鳔盘鮈与各水系间标本的差异系数均达不到亚种水平。南盘江组内,仅组7(罗平八大河)和组8(广南大里塘)标本的"腹鳍起点-背鳍起点距/体长"的差异系数大于1.28,但仅凭一个性状不足以用来区分云南盘鮈的不同地理居群;组7(罗平八大河)和组6(罗平多依河)标本的"腹鳍起点-背鳍起点距/体长"这一比例性状的差异系数大于1.28,但这一比例性状亦没有与其他性状构成一定的性状组合,不足以用来从形态上区分云南盘鮈与短鳔盘鮈。这就说明并不是所有的类群,或在不同水系分布的同一物种均会发生分化;另外,利用形态度量学未能找到进一步区分云南盘鮈与短鳔盘鮈的形态学证据,今后需要从分子生物学等方面寻找二者间新的分类学证据。     

CHO细胞无血清结团灌流培养：超声-沉降柱二合一灌流系统

利用CHO细胞能在培养过程中自然结团的特性,采用超声—沉降柱二合一灌流系统能促进细胞结团和加强截留的特性,我们用无血清培养基连续灌流培养基因重组CHO细胞MK3-A2株,分泌表达rhTNK-tPA获得了成功。培养周期为77-110天,细胞结团率为90%左右,直径在285～570μm之间,细胞截留率保持在95%左右,成活率为85%以上,细胞密度达到2×107/ml左右,rhTNK-tPA生产率平均为89 mg/L/d,最高时达216mg/L/d。 结果表明,使用该灌流系统进行细胞结团培养可以取代微载体培养用于动物细胞制药的规模化生产。     

质粒pUC18 DNA的螺线管型超螺旋结构

理论上,游离的超螺旋DNA可以采取两种结构形式：互缠式超螺旋和螺线管型超螺旋。前者早已被透射电子显微镜和原子力显微术的研究所证实,而后者却仍然缺乏足够的证据。使用温和的清亮裂解液法,从DNA拓扑酶野生型大肠杆菌HB101细胞抽提质粒pUC18 DNA。经CsCl-EB平衡密度梯度超离心分离获得超螺旋pUC18 DNA和松弛型pUC18 DNA(DNA Ⅱ）。纯化DNA分别用疏水必不容放亲水性溶剂系统的细胞色素单分子层展开技术制备电子显微镜标本。观察结果显示：在疏水性的甲酰胺－水展开系统中,DNA采取通常的互缠式结构;在含有1.5mmol/L醋酸铵的水介质中制备的超螺旋DNA标本,DNA采取线圈型结构,测得pUC18 DNA（单体）分子这种结构的外直径约为43.8nm,内直径约为2nm。在相同亲水介质中松弛型pUC18 DNA采取典型的螺线管型结构,其单体平均外直径约为53.1nm,内直径约为17.2nm。表明：在疏水介质中超螺旋DNA趋向于采取互缠式结构,而在亲水介质中DNA则要取螺线管型结构。DNA链之间可能存在非共价相互作用以维持这种结构。螺线管型结构可能是水溶液中的超螺旋DNA分子普遍的存在形式。     

用无血清培养基在填充床生物反应器生产 rHuEPO

在填充床生物反应器用含５％ＦＢＳ的ＤＭＥＭ：Ｆ１２培养基培养产重组人促红细胞生成素（ｒＨｕＥＰＯ）的细胞Ｃ_２８～１０ｄ后,使用自制的无血清生产培养基（ＳＦＭｐ）生产ｒＨｕＥＰＯ。ＳＦＭｐ培养基既能维持细胞生长,又能生产ＥＰＯ,也便于纯化分离ｒＨｕＥＰＯ。使用填充床生物反应器培养细胞,能维持培养２０～２５ｄ,ｒＨｕＥＰＯ表达水平达１２～２８.４ｍｇ／Ｌ之间,反应器的产率达到７１.０ｍｇ／Ｌ／ｄ,比滚瓶的产率增加１２～１４倍。葡萄糖最高消耗量达到２１ｇ／Ｌ／ｄ,细胞培养密度最高达到３.０×１０^７／ｍｌ以上,每次可收无血清培养上清８０～８７Ｌ。由于细胞被固定在聚酯片上,培养上清中脱落细胞很少。观察了反应器的乳酸和氨的含量,其结果表明乳酸和氨含量分别低于３.５ｇ／Ｌ和５ｍｍｏｌ／Ｌ,不影响产物的表达。经过多批培养和生长ｒＨｕＥＰＯ的结果表明,自行配制的ＳＦＭｐ培养基在该反应器能有效地维持细胞生长和生产ｒＨｕＥＰＯ。     

Tir细胞骨架偶联蛋白:大肠杆菌O157：H7的一种新的毒力因子

肠出血性大肠杆菌O157:H7是一种重要的传染性病原菌,可引起多种致死性疾病的爆发流行。Tir细胞骨架偶联蛋白(TccP)是近年来发现的O157:H7的一种新的重要的毒力因子,在O157:H7黏附宿主细胞造成黏附擦拭(A/E)损伤过程中起重要作用,TccP相关研究对阐明O157:H7致病机制具有重要意义。     

维甲酸促进小鼠F9细胞中STAT1的反式激活作用

维甲酸能促进肿瘤细胞的凋亡,诱导体外胚胎干细胞的分化,但作用机制的不明使其应用受到极大限制.因此,更多更全面地了解维甲酸的作用机制具有重要意义.本文构建了信号传导与转录激活因子（STAT1和STAT3）的真核表达载体 ,通过免疫荧光染色、电泳迁移率实验以及双荧光素酶报告基因检测系统证明, 维甲酸诱导可以激活转录因子STAT1促使其进入细胞核,并且增强STAT1蛋白与靶基因启动子的结合能力,从而发挥基因表达调控作用.本文结合后续的STAT1功能分析,试图建立起一种“维甲酸-转录因子-靶基因”的研究模式,有助于维甲酸作用机制的全面、系统的研究.这为临床上使用维甲酸作为抗肿瘤药提供理论基础,同时也为胚胎干细胞多能性调控机制研究提供新思路.