甲醇周期诱导控制强化毕赤酵母生产猪α干扰素

利用甲醇营养型毕赤酵母生产猪α干扰素(pIFN-α),诱导过程一般在高细胞密度、定值控制甲醇浓度于5～10g/L下进行,此时、溶解氧浓度(DO)自然下降到接近于0的水平。如果高好氧的毕赤酵母长期处在高甲醇/低DO的诱导浓度环境会导致其代谢活性恶化,胞内甲醇积累严重,pIFN-α表达生产效率低。为此,提出了一种甲醇周期诱导控制策略来强化pIFN-α生产。先将甲醇控制于高浓度达7h,再降低甲醇流加速率,将DO控制在20%左右约4h,一共重复6个循环。采用上述周期控制策略,毕赤酵母代谢活性可以长期维持在较高水平;胞内甲醇处于极低水平(≤0. 003g/g DCW),解除了甲醇毒性效应; pIFN-α活性达到3. 90×10~7IU/ml的最高水平,是定值控制甲醇浓度时的1. 86倍。     

添加表面活性剂改善丁醇萃取发酵性能

研究了各种表面活性剂对丁醇萃取发酵的影响。丁醇发酵中有大量H2、CO2气体生成,生成的气泡携带发酵溶剂产物（丁醇、丙酮）进入萃取液相,促进了水相中发酵毒性产物向萃取液相的移动。研究发现,表面活性剂可以降低气-液膜的表面张力,促使大气泡破碎,从而使发酵产气以较小气泡的形式穿过萃取液相。添加表面活性剂可以强化发酵溶剂产物从水相到萃取相的移除速度,缩短发酵产物在油水两相中达到平衡的时间。有利于提高发酵生产强度。以地沟生物柴油为萃取剂,吐温-80的添加量为质量分数0．140％时,与对照相比（无表面活性剂的萃取发酵）,相同发酵时间内萃取相中丁醇体积分数提高了21．2％．总溶剂生产强唐也提高了16．5％．     

植物乳杆菌胞外多糖包覆的高稳定性硒纳米颗粒的制备及其抗氧化活性的研究*

目的:以植物乳杆菌胞外多糖(EPS)作为稳定剂和包覆剂,安全、简便地制备高稳定性胞外多糖-纳米硒复合物(E-SeNPs),并研究其稳定性和抗氧化活性。方法:将植物乳杆菌胞外多糖引入亚硒酸钠与抗坏血酸的反应体系中,室温合成E-SeNPs。采用透射电子显微镜(TEM)、动态光散射(DLS)、紫外可见光谱(UV-vis)和傅里叶变换红外光谱(FT-IR)等技术对E-SeNPs的尺寸、形貌、结构及稳定性进行研究。此外,通过检测E-SeNPs的还原能力、ABTS⁺的清除率评估其体外抗氧化活性。结果:制备了具有良好分散性、稳定性的E-SeNPs,其平均粒径为(45.17±11.9)nm,带负电荷(-31.3mV)。同时,由于包覆作用,该E-SeNPs在水溶液中可稳定存在20天。最后,相同浓度下,E-SeNPs的还原力、ABTS⁺清除率都明显高于EPS和硒纳米颗粒(SeNPs),表现出了良好的抗氧化活性。结论:获得了一种新型的SeNPs稳定剂和包覆剂,简便、安全地制备了高稳定性、水分散性良好且具有良好抗氧化活性的SeNPs。     

甲醇/山梨醇共混流加控制溶氧改善毕赤酵母表达猪圆环病毒Cap蛋白的发酵性能

研究在重组毕赤酵母(GS115,Mut+)表达猪圆环病毒Cap蛋白的发酵过程中,甲醇毒害作用以及溶氧波动影响目的蛋白的正常表达。基于对甲醇和山梨醇代谢途径的分析,将C源流加的手动调节与反馈控制相结合,提出了1种新型的甲醇/山梨醇共混诱导策略,能够将溶氧稳定地控制于某一设定值,同时避免甲醇毒害作用。使用该策略将溶氧控制于20%的批次,C源(甲醇和山梨醇)添加过少,导致Cap蛋白表达量较低(54 mg/L);而将溶氧控制于10%的批次,C源流加速率适宜,Cap蛋白表达量达到198 mg/L,表达水平明显高于采用传统甲醇诱导策略(0 mg/L)和DO-stat诱导策略的批次(121 mg/L)。     

谷氨酸发酵过程葡萄糖自动流加系统

补料（流加葡萄糖）操作是谷氨酸发酵过程最重要的操作之一,工业上有各种各样的补料操作方法。控制葡萄糖浓度于一个较为平稳且适中的水平有利于提高谷氨酸发酵的性能指标。通过在线计量谷氨酸发酵中的氨水耗量并据此在线推定发酵液中的葡萄糖浓度,构建了一个谷氨酸发酵自动在线补料系统。使用该控制系统,谷氨酸发酵过程的葡萄糖浓度可以控制在任意水平,平稳、无波动的谷氨酸发酵可以得到实现。     

不同补料控制方式发酵生产头孢菌素C的性能比较

在7 L发酵罐下,对利用顶头孢霉菌(Cephalosporins acremonium)发酵生产头孢菌素C(CPC)过程的最优底物流加工艺进行了研究。提出了一种新式硫铵豆油耦联型的硫铵流加策略。该控制策略可将发酵液中的氨态氮浓度控制在3 6 g/L之间,同时满足了发酵前期细胞生长与CPC合成对氮源和硫源的需求,促进了顶头孢霉菌菌丝分化,为发酵后期的CPC高效生产奠定了前期基础。比较了CPC合成期内间歇、匀速和DO-Stat自动流加3种不同豆油流加方式的发酵性能。研究发现,耦联使用硫铵/后程通富氧空气DO-Stat法进行硫铵和豆油的同时补料和CPC发酵,可将碳源浓度与溶解氧浓度DO同时控制于适中水平,使CPC合成以高浓度和低副产物积累的方式进行,最终CPC浓度和得率分别达到35.77 g/L和13.3%。主代谢副产物脱乙酰氧头孢菌素C(DAOC)的积累量和DAOC/CPC分别仅有0.178 g/L和0.5%。     

甲醇/山梨醇共混流加诱导改变毕赤酵母生产猪α干扰素过程的代谢产能途径强化发酵性能

旨在探讨毕赤酵母生产猪α干扰素过程的代谢产能规律及其对发酵性能的影响。在10 L罐下,开展了不同诱导条件下的毕赤酵母高效发酵生产猪α干扰素过程的代谢酶学和能量再生分析研究。结果表明:甲醇单独诱导条件下、将诱导温度从30℃降低到20℃,胞内醇氧化酶(AOX)、甲醛脱氢酶(FLD)和甲酸脱氢酶(FDH)的比活性增加显著,细胞的甲醇代谢和甲醛异化产能能力、猪α干扰素抗病毒活性大幅提高,最高抗病毒活性达到1.4×106IU/mL,约为30℃诱导条件下的10倍。30℃、甲醇/山梨醇共混流加下,主要供能途径由甲醇单独诱导时的甲醛异化代谢转向TCA循环,甲醛异化供能途径被弱化、毒副产物甲醛的生成积累得到抑制,走向目标蛋白合成途径的甲醇分配比例得到提高。此时,最高抗病毒活性达到1.8×107IU/mL,是30℃甲醇单独诱导下最高活性的100倍以上。更加重要的是,共混流加诱导可以在常温、使用空气供氧的条件下进行,发酵成本明显下降、整体发酵性能改善显著。     

基于差分进化算法的酿酒酵母分批补料培养在线自适应控制

酿酒酵母分批补料培养中,葡萄糖添加过量会导致乙醇大量积累,破坏细胞结构及功能,降低葡萄糖利用效率;葡萄糖添加不足会限制细胞生长。为解决这一矛盾,提出了一种基于差分进化算法的在线自适应控制策略,并利用计算机仿真方法对该策略、传统的间歇流加、分段恒速流加及PID控制策略的控制性能进行了研究和比较。结果表明,在该控制策略下,发酵液中的乙醇浓度能够被稳定地控制在1g/L的低水平,而细胞浓度却达到34.45g/L的高水平,比采用间歇流加、分段恒速流加及PID控制策略的批次分别提高了243%、18%和29%。由此可知,该自适应控制策略能够将葡萄糖流加速率控制在适宜水平,避免乙醇过量积累的同时保证细胞的快速增殖。     

典型工业发酵过程环境变化下的细胞自适应行为与系统优化

工业发酵过程中,当细胞遭受到极端环境胁迫或剧烈环境变化时,细胞必须要作出必要的举动来适应环境的剧烈变化。细胞的自适应行为有可能不能应对剧烈的环境变化,导致发酵失败;但也有可能产生意想不到的效果,改善发酵性能。文中以毕赤酵母Pichia pastoris生产异源蛋白和丁醇发酵过程为例,阐述了环境变化条件下的细胞自适应行为及其基于自适应行为的发酵过程优化方法和策略,为利用基于细胞自适应行为的发酵过程优化提供参考。     

通过在低细胞浓度下启动甲醇诱导、优化碳/能量代谢模式促进毕赤酵母表达Monellin

重组毕赤酵母生产表达外源蛋白的过程中,一般在细胞达到高密度后开始启动甲醇诱导。也有报道指出,在较低细胞浓度下,启动甲醇诱导可以有效地控制整个发酵过程的溶解氧浓度,缓解毒副产物的积累,促进目标蛋白的表达。但是,该操作策略下,甲醇/能量调控机制不明,相关研究报道很少。文中以生产表达monellin(甜味蛋白)的重组毕赤酵母为模式菌株,通过在线分析计量甲醇消耗速率、CO2释放速率和O2摄取速率,探讨了不同细胞浓度下启动甲醇诱导和外源蛋白表达体系的甲醇/能量代谢模式。结果表明,在较低细胞浓度(50 g DCW/L)启动诱导并将温度控制在30℃,走向合成monellin前体物质途径的碳流最大(65%),且能与用于ATP再生的碳流形成最佳匹配;monellin的比合成速率与细胞比生长速率完全耦联,且耦联系数最大,比生长速率也较高;理论NADH(能量)利用效率η最高,η在甲醇诱导的绝大部分时段(89%)处于高水平(≥0.8),可以为monellin合成提供足够的能量。因此,该操作条件下,monellin浓度达到2.62 g/L的最高水平,是高细胞密度(100 g DCW/L)启动诱导策略下monellin浓度的2.5-4.9倍。