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61.
本文对mRNA差异展示法进行了改良,利用一组随机引物与来源于mRNA翻译起始位点区域的引物组合进行RT-PCR,使差异展示的片段来源于蛋白编码区,并对差异展示的条件进行了优化。应用此法对人鼻咽上皮与软腭口腔粘膜上皮扔基因表达进行了比较研究。得到了10个在鼻咽上皮特异表达的cDNA片段,并对其中的5个片段进行了亚克隆和序列分析。通过与GeneBank数据库中的序列进行同源性比较,确定其中两个片段为未 相似文献
62.
RT—PCR测定mRNA的荧光定量分析 总被引:7,自引:0,他引:7
利用反转录毛细管PCR技术,可合成代表特异mRNA的双链DNA。在一定循环数内,PCR产物的量与其模板cDNA即反转录中相应mRNA的浓度有关。溴乙锭嵌入DNA双螺旋后,其荧光量子产率大为增加,因此可通过利用处在适当PCR循环数中的cDNA浓度与在优选的激发光谱发现射波长下其荧光强度的线性关系,计算出所检测的mRNA表达量。 相似文献
63.
PCR扩增假单胞菌WBC-3的甲基对硫磷水解酶基因,插入表面展示质粒pYD1的多克隆位点,构建pYD1-MPH重组质粒。重组质粒转化酿酒酵母EBY100,2%半乳糖诱导甲基对硫磷水解酶表达,并利用免疫荧光检测甲基对硫磷水解酶在酿酒酵母细胞表面的表达展示。研究了表面展示甲基对硫磷水解酶的酶学性质和酵母工程菌对水体中甲基对硫磷的降解效果。结果表明成功构建具有全细胞甲基对硫磷水解酶催化活性的酵母工程菌,经2%半乳糖诱导48 h,表面展示甲基对硫磷水解酶比酶活力为18.2 U/mg细胞干重。表面展示甲基对硫磷水解酶的最适作用pH为9.5,最适作用温度为30℃,在p H4.0-10.5之间和45℃以下稳定性较好,Mn2+、Co2+、Zn2+、Ca2+、Hg2+、K+、Ni2+对表面展示甲基对硫磷水解酶活性有激活作用,Na+、Fe3+、Ag+对展示酶活力有抑制作用。工程菌在1 h内对淡水中20 mg/L的甲基对硫磷的降解率在80%以上。 相似文献
64.
噬菌体抗体库技术是获得治疗性抗体的一条重要途径。以20份健康人外周血为样本,通过提取淋巴细胞、逆转录-PCR(RT PCR)、抗体可变区基因的扩增、重叠PCR获得单链抗体(ScFv)基因,将ScFv克隆入噬粒载体,通过近300次的电转化获得了库容量为1.3×109的全人源天然ScFv噬菌体抗体库。通过随机挑克隆测序和用5种不同抗原筛选对抗体库进行了初步验证。随机测序表明抗体库具有较好的多样性,用5种不同抗原对其进行筛选,均获得了特异性噬菌体抗体的不同富集,表明成功构建了一个多样性良好的人源天然ScFv噬菌体抗体库。 相似文献
65.
66.
67.
应用mRNA差异显示技术,对比研究正常与白化大菱鲆有眼侧皮肤组织,克隆差异表达基因,经测序,RT-PCR验证,差异表达基因片段DEN-1(GenBank登录号:DQ886390)与DEN-2(GenBank登录号:DQ886391)均在白化大菱鲆有眼侧皮肤组织中下调表达;通过BLAST检索发现,DEN-1与GenBank中的斑马鱼和牛的类似尿苷二磷酸-葡萄糖:糖蛋白葡糖基转移酶(UGGT)基因、与挪威鼠类似尿苷二磷酸-葡萄糖:神经酰氨葡糖基转移酶1(Ugcgl1)基因有较高同源性;DEN-2与原鸡、斑马鱼、人、挪威鼠、家鼠和狗的眼缺乏同源框4(eya4)基因的同源性均较高。采用相对定量RT-PCR对正常鱼有眼侧皮肤(N1)、白化鱼有眼侧皮肤(A1)、正常鱼无眼侧皮肤(N2)、白化鱼无眼侧皮肤(A2)进行表达谱分析,以内参β-actin基因分别对DEN-1和DEN-2表达量进行标准化的光密度扫描显示:DEN-1和DEN-2在4种皮肤组织中有相似的表达模式,即表达量:N1>N2≈A2>A1。电子延伸将DEN-2延伸为497bp的片段,该延伸片段与多种动物的eya4基因在核酸和蛋白水平均有很高同源性。本研究对DEN-1和DEN-2的不同组织器官和不同发育阶段的电子表达谱分析,将对其进一步研究提供有价值参考。 相似文献
68.
SRp38基因研究进展 总被引:1,自引:0,他引:1
SR蛋白在前体mRNA可变剪接调控中发挥重要作用。可变剪接调节因子SRp38作为一种新近发现的具有神经及生殖组织特异性的SR蛋白,有典型的SR蛋白结构特征并能够调控GluR-B、TRK-C以及NCAML1等基因的可变剪接,但与其他SR蛋白不一致的是,SRp38可以在一定条件下(有丝分裂M期,热休克)抑制前体mRNA剪接,从而防止错误剪接的出现。SRp38的RRM结构域可以识别特殊的RNA序列并跟U1snRNP结合,而其RS结构域则参与调控前体mRNA剪接。SRp38的磷酸化状态可以影响其调控功能的发挥,在有丝分裂M期及热休克时,该蛋白质均呈去磷酸化状态。SRp38在爪蟾胚胎神经发育过程中发挥作用并且可以同TLS(translocation liposarcoma)蛋白相互作用,提示其可能通过调节前体mRNA可变剪接在神经系统的发育分化以及在肿瘤的发生中扮演角色。 相似文献
69.
70.
从噬菌体随机展示十五肽文库筛选出4个与轮状病毒粒子特异性结合多肽。经空斑减少抑制实验和MTT法分析表明其中3个多肽对病毒感染培养细胞具有抑制作用,其中序列为QSNPIHIITNTRNHP的C肽具有显著抑制作用,抑制效果达93%,另外2个多肽A和B抑制效果分别为40%与50%。经过多肽序列分析发现这3个十五肽具有2个保守序列,分别是第2至8个氨基酸残基SNPIHII和第12~15个氨基酸残基NIP。胰蛋白酶水解位点分析表明C肽无裂解位点,而A肽和B肽则分别具有3个和4个潜在水解位点。抑制病毒感染液中胰蛋白酶活性,发现A,B两肽也能显著地抑制病毒离体感染。说明所筛选的多肽2个保守序列的完整对抗病毒感染起着重要作用。C肽有望成为一种治疗轮状病毒感染的口服药物。 相似文献