人胰岛素A、B链基因的合成、克隆及其在大肠杆菌中的表达

根据人胰岛素A、B链的多肽顺序,设计并用一种简便快速的多肽基因合成了A、B链基因。合成的A 链和B 链基因分别克隆到pWR590质粒上,构建了表达型质粒pWR590-HIA和pWR 590-HIB,它们能够表达由β-半乳糖苷酶N-端约590个氨基酸残基与A 链或B 链组成的融合蛋白(两者之间由Met 连接)。A 链或B 链融合蛋白经BrCN 降解,磺化及分离纯化等步骤,得到了磺化A、B 链。磺化A、B链体外重组得到人胰岛素。     

幼年大鼠诱发排卵条件下卵巢前列腺素(PGs)的含量变化及其生理作用

本实验用幼年大鼠经PMSG/hCG诱发排卵,研究了印巢PGE_2、PGF_(2α) 、6-酮-PGF_(1α) 及TXB_2在排卵过程中的变化。实验表明卵巢PGE_2、PGF_(2α) 及6-酮-PGF_(1α) 在排卵前达到峰值,在排卵后,均趋下降。TXB_2未出现明显变化。受试动物经消炎痛处理后,不仅使排卵受到严重抑制,而对上述三种PGs在排卵前的上升也表现了显著的抑制。提示在卵泡破裂过程中PGs的重要调节作用,PGE_2、PGF_(2α)均可能参与排卵,其中尤以PGE_2的作用最为显著。     

臭曲霉(Aspergillus foetidus)启动子H8片段克隆及其序列

使用原核及真核菌通用的挑选启动子克隆载体pJGI,从臭曲霉菌体总DNA中分离到具有较好活性的启动子H8片段。根据Southern blot证明该启动子来自臭曲霉菌;H8全片段DNA序列分析结果表明其含有7 50bp,内含典型真核启动子功能序列(TA TA box)及增强子GTGG：TTTAAAG的相似序列,分析证实是一个新的臭曲霉启动子。初步实验表明该启动子不但在臭曲霉菌内有启动功能;并第一次证明来自臭曲霉菌的启动子在原核细胞中也具有启动子活性,能够表达完整的Lacz基因。     

条形柄锈菌吸器特异效应蛋白Hasp68抑制寄主免疫并与小麦组织蛋白酶B互作

作为活体营养专性寄生真菌,条形柄锈菌（小麦条锈病）在侵染过程中通过形成吸器向寄主细胞释放效应蛋白,干扰寄主的防卫反应,促进其侵染与致病。因此,条形柄锈菌效应蛋白的鉴定与功能研究对揭示其毒性机理具有重要意义。本实验室前期完成了条形柄锈菌CYR31生理小种吸器转录组分析,从中鉴定得到一个吸器特异诱导表达分泌蛋白Hasp68,利用农杆菌侵染在烟草细胞中瞬时表达该基因,能够抑制小鼠促细胞凋亡蛋白Bax诱导的细胞程序性死亡,鉴定为条形柄锈菌候选效应蛋白。Hasp68基因全长318bp,编码105_aa,N-端包含20_aa的信号肽,无保守结构域。BlastX分析表明Hasp68为条形柄锈菌特有效应蛋白,在其他真菌中无同源蛋白,且在条形柄锈菌16个菌系中呈较低的序列多态性,表明其在条形柄锈菌的进化过程中相对保守。借助荧光假单胞菌EtHAn的三型分泌系统,在小麦细胞中过表达Hasp68能够抑制由非致病细菌引起的PTI（PAMP-triggered immunity）相关胼胝质的积累;同时,也能抑制小麦与无毒条形柄锈菌互作中ETI（effector-triggered immunity）相关的活性氧爆发和过敏性坏死反应,表明效应蛋白Hasp68具有抑制寄主免疫反应的功能。利用酵母双杂交系统筛选Hasp68在小麦中的互作蛋白,发现其与组织蛋白酶B（cathepsin B）TaCTSB互作,双分子荧光技术进一步验证二者在烟草细胞中共表达存在互作,初步揭示了效应蛋白Hasp68的互作靶标。     

柯萨奇病毒B组3型基因组剪切片段的序列分析

柯萨奇病毒B组(Coxsackievirus B,CVB)感染细胞时其基因组RNA存在不稳定现象,但产生机制尚不清楚。本研究将柯萨奇病毒B组3型(CVB3)感染细胞后,利用5′ cDNA末端快速扩增技术(5′ rapid amplification of cDNA ends,5′ RACE)扩增并克隆细胞内CVB3基因组片段,并对每条序列及其5′端的二级结构进行分析。结果获得的20条CVB3基因组片段,长度为 2 067～5 547 bp,片段断端主要分布于2Apro和2C编码区。RNAfold分析显示,这些片段多数在5′断点端形成二级茎-环结构。本研究显示,CVB在宿主细胞感染时可形成大量不完整基因组RNA片段,这些片段可在5′断点端形成局部双链结构,提示片段不是随机产生,可能是RNA酶剪切产物。此发现有助于理解CVB基因组不稳定的机制。     

NF-κB在幽门螺杆菌感染介导的胃癌发生发展中的作用

目的:探讨核因子-κB(nuclear factor-κB,NF-κB)在幽门螺杆菌感染介导的胃癌发生发展中的作用。方法:选择2016年3月至2019年3月在本院诊治的胃部疾病患者110例,采用qPCR检测NF-κB相对表达情况,采用免疫印记法检测幽门螺杆菌(Helicobacter pylori,Hp)感染情况并进行相关性分析。结果:在110例患者中,病理诊断为胃癌9例(胃癌组)和良性胃部疾病101例(良性组,其中浅表性胃炎52例、萎缩性胃炎26例、不典型增生23例)。胃癌组的幽门螺杆菌感染率为88.9%,显著高于良性组的10.9%(P0.05)。胃癌组的NF-κB表达阳性率为77.8%,显著高于良性组的14.9%(P0.05)。在110例患者中,直线相关性分析显示幽门螺杆菌感染、NF-κB表达阳性与胃癌有显著正相关性(P0.05)。受试者工作特征曲线(receiver operating characteristic curve,ROC)显示幽门螺杆菌感染、NF-κB表达阳性鉴别诊断胃癌的曲线下面积分别为0.669和0.713。结论:NF-κB在胃癌中呈现高表达状况,也多伴随有幽门螺杆菌感染,两者存在显著相关性,共同介导胃癌的发生发展。     

滋养细胞胞内双链DNA感受器通过MAPK/IκB信号介导炎性细胞因子分泌

目的:探究滋养细胞能否感受胞内双链DNA刺激及其对炎性因子分泌的影响,揭示胎盘的免疫识别和免疫屏障功能,探讨妊娠期感染所致不良妊娠结局的发病机制。方法:利用人工合成的双链DNA模拟物poly (dA:dT)转染人滋养细胞系HTR-8/SVneo,Real-Time PCR方法检测滋养细胞胞内双链DNA识别受体的表达水平;Western Blot检测滋养细胞MAPK和IκB信号的活化情况;ELISA检测HTR-8/SVneo细胞培养上清中IL-6、IL-8、MCP-1、CXCL10的分泌水平。结果:Real-Time PCR结果表明,HTR-8/SVneo能够感受胞内双链DNA刺激并上调包括IFI16、AIM2、DHX36、DHX9、LRRFIP1、KU70、ZBP1/DAI和DDX41在内的多种双链DNA感受器的m RNA表达水平;Western Blot实验结果表明,滋养细胞识别双链DNA后能够促进MAPK和IκB信号通路活化,转染90分钟后ERK、JNK、p38和IκBα的磷酸化水平最高,其后随着时间逐渐减弱;加入IκB、p38和JNK特异性抑制剂能够抑制poly(dA:dT)介导的IL-8、IL-6和CXCL10分泌,但其分泌不受ERK抑制剂的影响;MCP-1的分泌能够被p38和JNK抑制剂阻断,但p38和ERK抑制剂不影响其分泌。结论:人滋养细胞存在功能性胞内双链DNA识别机制,活化的DNA识别信号能够激活MAPK和IκB信号通路,并通过IκB、p38或JNK信号介导IL-8、IL-6、MCP-1及CXCL10等细胞因子和趋化因子的分泌。     

血清同型半胱氨酸、叶酸、维生素B12水平与冠状动脉病变严重程度的相关性分析

摘要 目的：探讨血清同型半胱氨酸(homocysteine, Hcy)、叶酸、维生素B12水平与冠状动脉病变严重程度的相关性。方法：选取经冠脉造影检查确诊的稳定期冠心病患者220例为研究组,并以同期健康查体志愿者100例为对照组。检测和比较两组血清Hcy、叶酸、维生素B12和N -末端脑钠肽前体(N-terminal brain natriuretic peptide precursor,NT-proBNP)水平。研究组根据冠脉造影情况进行SYNTAX评分评价,通过心脏超声检查检测左室射血分数(left ventricular ejection fraction,LVEF),确定冠脉病变严重程度。比较研究组SYNTAX低分组(1～22分)、中分组(23～32分)和高分组(≥33分)患者上述各指标水平,并分析研究组血清Hcy、叶酸、维生素B12水平与其血清NT-proBNP 水平、SYNTAX评分和LVEF的关系。结果：与对照组比较,研究组血清Hcy和NT-proBNP水平升高而血清叶酸、维生素B12水平降低(P＜0.05)。研究组SYNTAX评分和LVEF分别为(28.76±6.58)分和(47.33±8.66)%,SYNTAX中分和高分患者血清Hcy和NT-proBNP水平高于SYNTAX低分患者而血清叶酸、维生素B12水平和LVEF则低于SYNTAX低分患者,SYNTAX高分患者血清Hcy和NT-proBNP水平高于SYNTAX中分患者而血清叶酸、维生素B12水平和LVEF则低于SYNTAX中分患者(P＜0.05)。Pearson线性相关分析结果显示研究组血清Hcy水平与其血清NT-proBNP 水平、SYNTAX评分均呈正相关(r=0.881,0.793,P＜0.05),与其LVEF则呈负相关(r=-0.876,P＜0.05);而其血清叶酸、维生素B12水平与其血清NT-proBNP 水平、SYNTAX评分均呈负相关(叶酸：r=-0.786,-0.825;维生素B12：r=-0.884,-0.818,P＜0.05),与其LVEF则呈正相关(r=0.893,0.859,P＜0.05)。结论：血清Hcy是冠心病的重要危险因素,其水平随着冠状动脉病变程度加重而升高;血清叶酸、维生素B12是冠心病的保护因素,其水平随着冠状动脉病变程度加重而降低。