丙型肝炎病毒E2糖蛋白糖基化作用的研究

本研究构建丙型肝炎病毒(HCV)糖蛋白E2的N-糖基化位点定点突变体。采用高保真性的Pfx DNA聚合酶,设计两对引物,分别引入两个突变位点,通过PCR体外定点突变,使E2第535、583位核苷酸由A突变为T,从而使AAC编码的天冬酰氨突变为TAC编码的酪氨酸,使得N-糖苷化位点NNT、NST突变为YNT、YST.结果得到两个单位点以及一个双位点突变体,并将突变型E2连接到真核表达载体peDNA3．1(-)／Myc—HisB上。成功获得的3个HCVE2糖蛋白糖基化位点定点突变体,为进一步进行HCVE2糖蛋白糖基化位点与分子伴侣之间的相互关系以及突变体对机体的免疫功能的影响的研究奠定了基础。     

栝楼籽中一种新的具有蛋白质生物合成抑制活性的多肽——Trichokirin-S1的分离、纯化和性质

改进了常规的核糖体失活蛋白的分离纯化方案 ,首先采用抽提蛋白体的方法 ,提高了分离效果 ,然后再经硫酸铵分级沉淀、FPLCMonoS阳离子交换层析和Superose12凝胶过滤层析等步骤 ,从栝楼种子中分离到一种新的多肽———trichokirin S1。经MALDI TOFMS质谱分析测得其分子量为 114 2 6。该肽的N端氨基酸序列为PRRKEG GSFDECCSE ,与一种存在于南瓜籽中的小分子核糖体失活蛋白 β moschin具有很高的同源性。trichokirin S1对核糖体失活的机制与天花粉蛋白 (TCS)一致 ,是rRNAN 糖苷酶催化型的 ,对兔网织红细胞裂解液系统蛋白质生物合成有较强的抑制作用 ,IC50 为 0 .71nmol L ,因而有可能开发成免疫毒素的高效“弹头”。     

重组人粒细胞集落刺激因子的N端氨基定点PEG化修饰

尽管重组粒细胞集落刺激因子(rhG-CSF)具有重大的治疗价值,然而在实际应用却受到体内半衰期过短因而需要频繁重复注射的限制．为了解决这一问题,我们利用两种不同分子量（5 kD和 20 kD）的单甲氧基聚乙二醇丙醛（mPEG-PAL）对rhG-CSF的N端氨基进行了定点PEG化修饰．通过正交实验的统计学方法得到了最适修饰条件．研究发现,PEG化后的rhG-CSF具有了更高的体外稳定性,其体内活性也得到了很大提高,体内作用时间得到很大延长．因此,对于rhG-CSF的N端氨基定点PEG化修饰,可以显著提高rhG-CSF的临床应用价值．     

利用乳酸乳球菌AcmA表面展示b-1, 3-1, 4-葡聚糖酶

采用PCR扩增乳酸乳球菌(Lactococcus lactis)MB191菌株的全长肽聚糖水解酶基因acmA, 通过C-末端融合构建了与绿色荧光基因gfp的融合基因acmA-gfp, 再连接于表达载体pMG36k上后得到可组成型表达AcmA-GFP融合蛋白的重组质粒pMB137, 然后将该质粒电转化导入到乳酸乳球菌AS1.2829中获得重组菌MB137。经SDS-PAGE检测, 重组菌MB137可表达预期的分子量约74 kD的蛋白质。Western blotting、细胞分级分离组分的荧光活性测定和特异GFP二抗标记的流式细胞仪检测证实GFP被成功锚定在重组菌细胞表面, 被锚定蛋白约占总表达融合蛋白的35%。进一步通过从枯草芽胞杆菌BF7658基因组中扩增去信号肽序列的b-1, 3-1, 4葡聚糖酶基因gls, 来取代pMB137中的gfp, 得到携带融合基因acmA-gls的重组质粒pMB138, 经导入到乳酸乳球菌AS1.2829后得到重组菌MB138, 其全细胞b-1, 3-1, 4-葡聚糖水解酶的活性约为12 U/mL菌液, 明显高于对照菌株。     

N-氨甲酰基-D-氨基酸酰胺水解酶的固定化工艺

以TJS环氧基树脂作为载体对N-氨甲酰基-D-氨基酸酰胺水解酶进行固定化,最佳工艺条件为：1g树脂载体大约对应133U酶液,蛋白质量浓度0.35mg/mL,固定时间15h,温度28℃,pH7.5,固定化酶活达到58.5U。蛋白固定率可达97.4%,酶活回收率达到49.3%,得到的固定化酶使用半衰期达到26批。     

植物中吡咯里西啶生物碱的检测与分析

吡咯里西啶生物碱广泛分布于植物界。很多吡咯里西啶生物碱对动物和人类有严重的毒性作用,包括肝脏毒性,肺脏毒性,致癌作用,致突变作用和神经毒性等。本文综述了植物中吡咯里西啶生物碱的分离,纯化,检测与分析。     

裂褶多糖的羧甲基化

采用氢氧化钠-氯乙酸反应体系,以异丙醇为溶剂,利用L9(34)正交试验合成mg级的不同取代度(DS)的羧甲基化裂褶多糖。研究表明试验条件下各因素对DS值影响由大到小的顺序为:氯乙酸/裂褶多糖(g/g)>氢氧化钠/裂褶多糖(g/g)>反应时间>反应温度。其红外光谱在1600 cm-1出现-COO-特征吸收;其紫外光谱在200~300 nm没有明显的吸收峰。对其13C NMR化学位移进行了归属。     

氯喹对戊四氮致痫大鼠皮质和海马谷氨酸和NMDAR1表达的影响

目的观察氯喹对戊四氮致痫大鼠皮质和海马谷氨酸(glutamate,Glu)和N-甲基-D-天冬氨酸受体1(NMDAR1,NR1)表达的影响,探讨氯喹在癫痫发生发展过程中对神经递质传导的作用。方法48只健康雄性SD大鼠随机分为对照组(12只)、戊四氮致痫组(60mg/kg,i.p.,18只)和氯喹干预组(0.61mg/kg,i.c.v.,18只)。每组分6个时间点:1h、2h、4h、8h、12h和24h。观察大鼠行为表现和脑电图改变,用免疫组化检测大鼠皮质和海马Glu和NR1的变化。结果对照组无痫样发作,戊四氮致痫组有重型的痫样发作(Ⅲ-Ⅴ级),氯喹干预组有轻型的痫样发作(Ⅰ-Ⅲ级)(P<0.05);戊四氮致痫组脑电记录呈频发高幅的痫样波,氯喹干预组痫样波幅低且缓;Glu和NR1在戊四氮致痫组表达强,以海马为著,与对照组比较有显著性差异(P<0.05),氯喹干预组与对照组比较无显著性差异(P>0.05)。结论氯喹通过对戊四氮致痫大鼠皮质和海马神经递质Glu和NR1信号传导通路的抑制作用,影响致痫大鼠痫样发作的发生和发展。     

蛋白质的甲基化研究进展

蛋白质翻译后修饰是调控蛋白质生物学功能的重要步骤之一。甲基化修饰作为蛋白质翻译后修饰的一种重要形式,参与了真核生物和原核生物的多种细胞进程。本文综述了目前蛋白质甲基化的研究进展,包括真核生物、原核生物,组蛋白和非组蛋白,以及多种氨基酸位点的甲基化修饰。这些发现丰富了人们对蛋白质甲基化修饰的认识,对深入了解蛋白质翻译后修饰的功能具有重要意义。     

草地螟普通气味结合蛋白Ⅰ（Lsti-GOBP1）蛋白表达纯化及结合特性分析

气味结合蛋白在昆虫对寄主挥发性气味识别过程中有着重要的生理功能。本研究通过对草地螟Loxostege sticticalis L. 普通气味结合蛋白Ⅰ（Lsti-GOBP1）进行克隆及原核表达的基础上, 分离纯化得到体外重组的Lsti-GOBP1蛋白。并利用N-苯基-1-萘胺(N-phenyl-1-naphthylamine, 1-NPN）作为荧光探针研究了Lsti-GOBP1蛋白与醇类、 醛类、 酯、 烯等50种气味标样的结合特性, 结果表明Lsti-GOBP1可与其中35种气味化合物结合, 但只有1-己醇、 1-庚醇、 肉桂醛和莰烯4种气味标样能在20 μmol/L浓度（探针与蛋白结合的饱和浓度值）下将1-NPN从Lsti-GOBP1中替换50%, 其结合常数分别为8.997, 7.283, 7.289 和9.814 μmol/L。据此可以得出, Lsti-GOBP1蛋白的气味物质结合谱很广, 同时具有较强的特异性, 其中1-己醇、 1-庚醇、 肉桂醛、 莰烯等化合物在草地螟识别寄主植物气味物质的过程中起重要作用。