柯萨奇病毒B组3型基因组剪切片段的序列分析

柯萨奇病毒B组(Coxsackievirus B,CVB)感染细胞时其基因组RNA存在不稳定现象,但产生机制尚不清楚。本研究将柯萨奇病毒B组3型(CVB3)感染细胞后,利用5′ cDNA末端快速扩增技术(5′ rapid amplification of cDNA ends,5′ RACE)扩增并克隆细胞内CVB3基因组片段,并对每条序列及其5′端的二级结构进行分析。结果获得的20条CVB3基因组片段,长度为 2 067～5 547 bp,片段断端主要分布于2Apro和2C编码区。RNAfold分析显示,这些片段多数在5′断点端形成二级茎-环结构。本研究显示,CVB在宿主细胞感染时可形成大量不完整基因组RNA片段,这些片段可在5′断点端形成局部双链结构,提示片段不是随机产生,可能是RNA酶剪切产物。此发现有助于理解CVB基因组不稳定的机制。     

miR-195通过靶向调控趋化因子5促进胃癌细胞增殖、转移及侵袭的实验研究

目的:研究miR-195通过靶向调控趋化因子5促进胃癌细胞增殖、转移及侵袭的分子机制。方法:选取MGC803及NCI-N87细胞,根据转染不同分为:miR-NC组(空质粒),miR-195-mimics组(模拟序列)。实时荧光定量PCR法检测miR-195表达;MTT检测细胞增殖能力;Transwell侵袭实验检测细胞侵袭力;细胞划痕实验检测细胞转移能力;流式细胞术检测细胞凋亡情况;Western blot检测chemokine 5表达水平;Spearman相关分析miR-195及chemokine 5相关性。荧光素酶实验验证miR-195与chemokine 5的靶向关系。结果:miR-195-mimics组细胞miR-195水平高于miR-NC组(P0.05);miR-195 mimics组第1、2、3、4 d细胞活力低于miR-NC组(P0.05);miR-195 mimics组G1细胞高于miR-NC组,G2期、S期细胞低于miR-NC组,G2/S期细胞比值低于miR-NC组(P0.05);miR-195 mimics组划痕距离大于miR-NC组(P0.05);miR-195 mimics组细胞侵袭数低于miR-NC组(P0.05);miR-195-mimics组细chemokine 5蛋白含量低于miR-NC组(P0.05);miR-195 m RNA水平与chemokine 5蛋白含量负相关(r=-0.398,P=0.00);miR-195可直接靶向chemokine 5。结论:miR-195可通过靶向chemokine 5促进胃癌MGC803及NCI-N87细胞的增殖、转移及侵袭。     

1-6岁儿童维生素D与年龄、性别、季节及体质量指数的关系研究

目的:探讨1-6岁儿童维生素D与年龄、性别、季节及体质量指数(BMI)的关系,为临床有效指导维生素D的补充提供参考依据。方法:选取2000年1月～2019年1月于我院接受体检的1～6岁儿童816例作为研究对象。采用电化学发光法检测所有研究对象的血清25-羟维生素D[25(OH)D]水平,并分析血清25(OH)D水平与儿童年龄、性别、BMI以及季节的关系。结果:816例儿童维生素D营养不足和缺乏人数占比为14.83%。1～3岁儿童血清25(OH)D水平高于3～6岁儿童(P0.05)。男童血清25(OH)D水平高于女童(P0.05)。肥胖儿童血清25(OH)D水平低于正常与超重儿童,且超重儿童血清25(OH)D水平低于正常儿童(均P0.05)。春、夏季儿童血清25(OH)D水平均高于秋、冬季儿童(均P0.05)。结论:1～6岁儿童的维生素D营养状况不容乐观,随着年龄的增长儿童血清25(OH)D水平显著降低,且男童高于女童,春、夏季高于秋、冬季。临床工作可通过增加其户外活动,继而达到改善维生素D营养状况的目的。     

人PINK1-shRNA载体的构建及对神经母细胞瘤细胞线粒体的影响

摘要 目的：构建筛选人源靶向特异PINK1-shRNA敲减质粒,转染神经母细胞瘤SH-SY5Y细胞并验证该质粒转染后对PINK1基因的敲减效率,观察对细胞线粒体形态的影响。方法：构建两对人源PINK1-shRNA序列(编号分别为PINK1-shRNA-39和PINK1-shRNA-42),将这2对干扰序列连接在载体上形成重组载体,经测序验证后,将空载体和两对敲减质粒分别转染SH-SY5Y细胞,获得基因敲减的细胞模型,用CCK-8法检测细胞的存活率,用荧光定量PCR方法确定PINK1基因的敲减效率,用蛋白质免疫印迹法验证细胞内PINK1的表达水平是否发生改变,用激光共聚焦显微镜观察线粒体的形态是否发生了改变。结果：我们提取的质粒,经测序结果显示,质粒载体构建成功;转染细胞后,CCK-8 法检测细胞存活率发生了降低,与正常组比较,PINK1-shRNA-39和PINK1-shRNA-42敲减质粒组,细胞的存活率分别降低了13.7%（P＜0.05）和14.1%（P＜0.05）;荧光定量PCR结果显示,与正常组相比,PINK1-shRNA-39组和PINK1-shRNA-42组敲减质粒转染的细胞内PINK1基因的表达分别降低了24.1%（P＜0.01）和36.7%（P＜0.01）;蛋白质印迹法结果显示,与正常组相比,两对质粒分别转染细胞后,PINK1-shRNA-39和PINK1-shRNA-42敲减质粒转染的细胞内PINK1蛋白的表达水平降低,差异有统计学意义(P＜0.01),PINK1-shRNA-42敲减质粒转染的细胞内PINK1蛋白的表达水平有效降低更明显;与正常组比较,激光共聚焦显微镜观察到基因敲减两组细胞的线粒体部分发生断裂,碎片较多,基因敲减两组的线粒体的形态因子显著降低,差异有统计学意义（P＜ 0.01）。结论：成功构建了人源的PINK1基因敲减的质粒,并将敲减的质粒成功转染至SH-SY5Y 细胞中,细胞内PINK1基因的mRNA和蛋白的表达水平降低,且细胞线粒体的形态发生了改变。     

肺炎支原体感染对儿童血常规参数及C反应蛋白水平的影响

摘要 目的：探讨肺炎支原体（Mycoplasma pneumoniae, MP）感染对儿童血常规数及C反应蛋白（C reactive protein, CRP）水平的影响。方法：以60例肺炎支原体抗体（MP-IgM）阳性患儿作为观察组,选取同期60名MP-IgM阴性儿童作为对照组,对两组患儿血常规参数和CRP水平进行回顾性分析。结果：与对照组比较,观察组红细胞压积、血红蛋白、单核细胞比例、单核细胞计数、中性粒细胞比例、中性粒细胞计数、红细胞计数均数或中位数升高,嗜碱性粒细胞比例、嗜碱性粒细胞计数、嗜酸性粒细胞比例、嗜酸性粒细胞计数、淋巴细胞比例（LY）、淋巴细胞比计数（LY#）、平均红细胞血红蛋白量、红细胞平均体积、平均血小板体积、血小板压积、血小板分布宽度、血小板计数、红细胞分布宽度均数或中位数降低;观察组患儿的CRP水平中位数显著高于对照组,以上差异有统计学意义（P<0.05）;Logistic多元回归分析结果显示,MP感染与淋巴细胞比例、淋巴细胞比计数降低具有正相关性（P<0.05）。结论：MP感染患儿的血常规参数和CRP水平均发生变化,临床医生应对这些参数给予关注和连续监测,从而提高诊疗效果。     

维生素D缺乏与儿童反复呼吸道感染的关系及机制

呼吸道感染是常见的儿科疾病,有着显著的发病率和死亡率,反复呼吸道感染会严重影响儿童的生活质量和身体健康。维生素D具有一系列与人体健康有关的作用,包括与呼吸道的感染有关。为了分析维生素D与儿童反复呼吸道感染的关系,探讨维生素D影响呼吸道感染的机制,本研究通过临床分析了维生素D缺乏与儿童反复呼吸道发生之间的相关性,通过构建炎症模型,观察了外源维生素D对人气道上皮细胞增殖分化的影响,运用ELISA检测了维生素D对人气道上皮细胞和中性粒细胞释放炎症因子(IL-1β,IL-6和TNF-α)的影响。本结果表明,维生素D缺乏与儿童反复呼吸道感染相关,并且维生素D能促进人气道上皮细胞的增殖分化,但对人气道上皮细胞和中性粒细胞炎症因子的产生无显著影响。     

肝素C5异构酶的表达优化及分子改造

肝素和硫酸乙酰肝素是一类应用于临床抗凝血的糖胺聚糖。肝素葡萄糖醛酸C5异构酶(Heparosan-N-sulfate-glucuronate 5-epimerase,C5,EC 5.1.3.17) 是肝素和硫酸乙酰肝素合成过程中重要的修饰酶,催化N-硫酸化肝素前体 (N-sulfoheparosan) 的D-葡萄糖醛酸 (D-GlcA) 上5号位羧基翻转生成L-艾杜糖醛酸 (L-iduronic acid,L-IdoA)。文中以大肠杆菌Escherichia coli为宿主对斑马鱼来源的肝素葡萄糖醛酸C5异构酶基因Glce进行重组表达优化与分子改造。比较了3种不同的表达载体pET20b(+)、pET28a(+) 和pCold Ⅲ对C5表达的差异情况,其中以嗜冷启动型载体pCold Ⅲ表达酶活最高,达到(1 873.61±5.42) U/L。为了进一步提高C5的可溶表达量,在N端融合促溶标签SET2后,可溶蛋白表达量比对照提高了50%,酶活达到 (2 409.25±6.43) U/L。在此基础上,通过理性设计对底物结合口袋进行定点突变,获得最优突变体 (V153R) 的酶活和比酶活分别为 (5 804.32±5.63) U/L和(145.14±2.33) U/mg,是原始酶的2.41倍和2.28倍。肝素C5异构酶改造与表达优化为酶法催化合成肝素奠定了基础。