基于Taqman-MGB探针的亚稀褶红菇实时荧光定量PCR检测方法

本研究建立了一种基于Taqman-MGB探针的亚稀褶红菇Russula subnigricans实时荧光定量PCR检测方法。根据亚稀褶红菇与其近似种的内转录间隔区（internal transcribed spacers,ITS）序列差异,设计合成1对引物和1条特异性Taqman-MGB探针,并用常见有毒红菇种类进行验证。结果显示,引物特异性良好,仅亚稀褶红菇出现荧光信号,完成整个检测过程只需2h。该法能够为毒蘑菇中毒的快速检测提供技术支持。     

基于纳米颗粒的赭曲霉毒素A高灵敏酶联免疫检测方法的建立及应用

赭曲霉毒素(ochratoxins)主要是由青霉菌Penicillium和曲霉菌Aspergillus产生的有毒次级代谢产物,常见于发霉或发酵的农产品中,其中赭曲霉毒素A(ochratoxin A,OTA)毒性最强且最为普遍。OTA是粮食作物和饲料的重要污染物,在加工、储存或运输过程中均可产生,具有肾毒性和免疫毒性,可通过蓄积作用发挥毒性效应,对人类和动物健康造成严重威胁。本研究通过将OTA单克隆抗体包被于纳米磁珠(magnetic nanoparticles,MNPs)表面,获得具有免疫活性的磁珠抗体复合物(MNPs-Anti OTA),并制备生物素标记的偶联抗原OTA-BSA-Bio,后续采用链酶亲和素标记的纳米金颗粒(Strep-HRP-AuNPs)催化底物进行信号检测,最终建立了OTA高灵敏检测方法(MNPs-bs-AuNPs-ELISA)。在最优条件下,经计算该方法检测下限(IC10)为0.01ng/mL,检测区间(IC20-IC80)为0.02-0.73ng/mL,半数抑制率(IC50)为0.13ng/mL。与OTA类似物OTB、OTC交叉反应性为4.3%和8.1%,对其他常见真菌毒素AFB1、ZEN、FB1、DON、CIT和PAT均无交叉反应。玉米、面粉和大豆样本中的加标回收率可达85.6%-115.7%,对天然样本中OTA含量的检测结果表明,该方法与LC-MS/MS相关性良好。本研究建立的MNPs-bs-AuNPs-ELISA可满足谷物及饲料样本中OTA的快速、高灵敏度定量检测,成本较低,具有很好的应用前景。     

马氏珠母贝前列腺素E合酶2基因PGES-2的克隆与表达分析

前列腺素E合酶2 (prostaglandin E synthase, PGES-2)是一种核周蛋白,是前列腺素E_2(prostaglandin E_2, PGE_2)合成的末段限速酶之一。研究发现,PGES-2通过与上游诱导酶偶合形成通路调节PGE_2产生方式参与有机体炎症反应、神经系统疾病、促进组织溃疡等各种病理生理事件。为探索马氏珠母贝前列腺素E合酶2 (Pinctada fucata martensii, Pm-PGES-2)的序列特征及其表达情况,本实验通过RACE技术克隆出马氏珠母贝PGES-2基因的cDNA全长序列(Pm-PGES-2),并通过生物信息学软件分析该序列的功能结构;运用实时荧光定量技术检测马氏珠母贝PGES-2基因在各组织中的相对表达量。实验结果显示马氏珠母贝PGES-2基因cDNA序列全长1 419 bp,其中开放阅读框993 bp,编码330个氨基酸,非翻译区5 UTR长170 bp,3 UTR长256 bp。荧光定量PCR检测结果显示该基因在肝胰腺中表达量最高,鳃、边缘膜次之,各组织表达量差异具统计学意义(p0.05)。本研究为进一步探究PGES-2在马氏珠母贝中的生物学功能提供研究基础。     

不同抗性苹果品种应答轮纹病菌胁迫的差异蛋白质组分析

为鉴定不同抗性苹果(Malus domestica)品种响应轮纹病菌胁迫的抗性相关蛋白表达差异, 以抗病品种华月及易感品种金冠为试材, 采用高通量同位素标记定量(IBT)技术结合液相色谱-串联质谱(LC-MS)鉴定技术, 对病原菌处理前后抗、感病品种叶片的蛋白质组差异表达进行分析, 共鉴定出171个差异表达蛋白(DEPs)。GO富集及KEGG通路分析表明, 在细胞组分、分子功能和生物过程3类中共注释到686个GO条目, 其中52个DEPs注释于KEGG通路的18个显著差异途径(P<0.05)。亚细胞定位预测分析表明, 171个DEPs中有170个分别定位于8类细胞器。蛋白功能注释分析表明, 46个DEPs注释于7类抗性相关蛋白, 包括类甜蛋白、过氧化物酶、多酚氧化酶、过敏原蛋白、几丁质酶、内切葡聚糖酶以及主乳胶蛋白。此外, 还对抗性相关蛋白的表达特点及基因定量结果进行了分析。该研究结果可为进一步解析抗、感病苹果品种应答轮纹病菌胁迫的抗性机制提供参考。     

非洲猪瘟病毒微滴式数字PCR检测方法的建立与应用

为建立一种特异性强、灵敏度高、重复性好的非洲猪瘟病毒微滴数字PCR检测方法,本研究根据非洲猪瘟病毒核酸的2段保守序列(VP72和K205基因)设计合成了3对引物和探针,摸索其反应条件,优化方法,比较方法的线性、特异性、灵敏性和重复性。结果发现,这3对引物和探针的非洲猪瘟病毒方法检出限均小于6拷贝数/反应,在10～106拷贝数/反应之间均呈良好的线性关系,定量范围内的检测变异系数均低于15%,且不与猪常见的2种病毒发生交叉反应,适用于猪肉及其制品中非洲猪瘟病毒的检测,有利于在源头、食品加工、食品销售等各个环节加强对生鲜猪肉及各类猪肉制品中非洲猪瘟病毒的检测,切实降低潜在风险。     

口蹄疫病毒非结构蛋白3AB双抗体夹心ELISA方法的建立

抗原纯净度是口蹄疫 (Foot-and-mouth disease,FMD) 灭活疫苗质量检验的一项重要内容,一般采用疫苗2–3次免疫动物后,检测非结构蛋白 (Non-structural protein,NSP) 抗体是否阳转,判断疫苗抗原的纯净度。文中旨在建立定量检测FMD灭活疫苗抗原中NSP 3AB含量的ELISA方法,为疫苗质量控制提供参考方法。利用口蹄疫病毒 (Foot-and-mouth disease virus,FMDV) NSP 3A单克隆抗体和辣根过氧化物酶 (Horseradish peroxidase,HRP) 标记的3B单克隆抗体,建立定量检测NSP 3AB含量的双抗体夹心ELISA检测方法。采用原核表达并纯化的3AB蛋白作为标准品,标准品系列稀释,绘制标准曲线,以标准品与未加抗原的阴性对照吸光值 (OD) 的比值大于2.0的标准品最低浓度为最低检测限。标准品浓度介于4.7–600.0 ng/mL之间时,测得的OD值与浓度呈线性相关,回归曲线呈直线,相关系数R2=0.99,确定最低检测限为4.7 ng/mL。检测12份未纯化灭活抗原中3AB蛋白含量介于9.3–200.0 ng/mL之间;而纯化后的病毒抗原中3AB蛋白残留量低于最低检测限;33份来自不同厂家的成品疫苗抗原中9份疫苗抗原3AB蛋白含量在9.0–74.0 ng/mL之间,其余24份疫苗抗原中3AB蛋白残留量低于最低检测限。检测3AB蛋白含量的双抗体夹心ELISA方法能够特异、敏感地检测疫苗抗原中的3AB蛋白含量,为疫苗质量控制与纯净度检验提供了一种可供选择的检测方法。     

军曹鱼催乳素受体PRLR1基因的克隆及其在不同盐度条件下mRNA表达差异

催乳素受体通过结合催乳素,能调节鱼体渗透压。为研究催乳素受体1(PRLR1)在高盐水体和低盐水体中对军曹鱼(Rachycentron canadum)的渗透调节作用,利用cDNA末端快速扩增(RACE-PCR)技术,获得了军曹鱼PRLR1全长cDNA序列。该基因全长为2629 bp,包含1953 bp的开放阅读框ORF,可编码650个氨基酸。氨基酸序列包含了2个纤维连接蛋白3型结构域(FN3)、保守的WS区和box1。采用qRT-PCR技术,检测不同盐度(10‰、30‰和35‰)条件下鳃、肠、体肾中PRLR1基因mRNA表达情况。结果显示,PRLR1基因在军曹鱼的各个组织中均有表达,其中鳃表达量最高,其次是肌肉、体肾和肠,而在胃、脾、脑和心脏中则微量表达。低盐组、正常组和高盐组中,PRLR1基因的表达量均为鳃最高;肠次之;体肾最低。随着盐度提高,PRLR1基因的鳃、肠和体肾组织表达量变化规律均呈逐步下降趋势。以上结果反映了军曹鱼PRLR1在渗透压器官中的功能差异性,说明PRLR1在军曹鱼渗透压调节上具有重要作用。     

铁皮石斛DoSMT2基因的克隆与表达分析

为了解SMT2基因在铁皮石斛（Dendrobium officinale）甾醇代谢过程中的作用,利用RACE技术克隆到1个DoSMT2基因,开放阅读框为1 089 bp,编码362个氨基酸,DoSMT2相对分子量为40.345 kD,理论等电点为8.13,属于稳定的亲水性蛋白。经BLAST P检索,DoSMT2蛋白属于AdoMet-MTases超级家族,含有4个S-腺苷蛋氨酸结合位点、1个甲基转移酶保守结构域和1个甾醇甲基转移酶C末端保守结构域。系统进化分析表明,DoSMT2与深圳拟兰（Apostasia shenzhenica）的SMT2亲缘关系最近,确定其属于SMT2家族。qRT-PCR分析结果表明,DoSMT2基因在茎和叶都能表达,10月份的表达量最高,叶片的表达量显著高于茎,推断叶片的甾醇代谢比茎活跃。构建了pET-29a-DoSMT2原核表达载体,并转化大肠杆菌BL21（DE3）,IPTG诱导表达出预期大小的蛋白。这为铁皮石斛DoSMT2的甲基化机制及甾醇化合物代谢研究奠定基础。