异源黑色素瘤DNA疫苗结合IL-12和Ii-PADRE抗鼠黑色素瘤的研究

研究酪氨酸激酶相关蛋白2(tyrosinase related protein 2,TRP-2)和gp100质粒DNA在B16黑色素瘤小鼠模型中的抗肿瘤作用。TRP-2及gp100在人类和鼠类黑色素瘤中均高度表达。鼠源gp100(mgp100)和鼠源TRP-2(mTRP-2)在小鼠中的免疫原性较差,而异源黑色素瘤相关抗原可打破这些免疫耐受。使用电脉冲法免疫人源gp100(hgp100)和人源TRP-2(hTRP-2)质粒在B16F10肿瘤模型中表现出显著的保护作用。TRP-2和gp100质粒免疫结合Ii-PADRE(invariant Pan DR reactive epitope)和鼠源白介素-12(murine interleukin-12,mIL-12)质粒有效消退了建立的皮下B16F10肿瘤。上述结果表明,肌肉内注射异源DNA疫苗结合Ii-PADRE与IL-12质粒使用可能是一种有效治疗黑色素瘤的策略。     

溶瘤腺病毒靶向杀灭葡萄膜黑色素瘤的实验研究

葡萄膜黑色素瘤是成人最严重的原发性恶性肿瘤之一.传统的治疗方法,包括手术、放射治疗和化学治疗效果都不是很理想.溶瘤腺病毒H101,能够特异性地在p53突变的肿瘤细胞中复制并杀伤肿瘤细胞,同时对正常细胞影响较少,且已由中国国家食品药品监督管理总局批准上市.为了研究H101对葡萄膜黑色素瘤的治疗效果,通过体外感染葡萄膜黑色素瘤细胞,发现H101能够显著抑制葡萄膜黑色素瘤细胞的增殖并促进细胞凋亡,抑制细胞周期,而对正常的ARPE-19细胞没有影响.在体内实验中,建立了SP6.5细胞的荷瘤小鼠模型,在H101治疗后抑制了肿瘤的生长,延长了动物寿命.上述结果表明,溶瘤腺病毒H101治疗葡萄膜黑色素瘤是一种可行的方法.     

TN—C与MDA-7在增生性瘢痕中表达与调控

增生性瘢痕是以皮肤损伤后成纤维细胞过度增殖为特征的一种病理改变,其发病机制尚不明确,目前没有有效的治疗方法。当皮肤组织损伤时,腱糖蛋白C（Tenascin-C,TN-C）具有多种不同的作用介导炎症和纤维化进程,并使组织有效修复。TN—C是细胞外基质中一个具有独特的六聚体结构的寡聚糖蛋白家族,TN—C一过性表达在器官形成期,在大多数成人组织不表达或表达极少。然而,在病理条件下TN—C表达增加,诸如炎症,伤口愈合和纤维化。TN—C参与胚胎形成、肿瘤发生及损伤修复过程有关,参与细胞黏附、增殖、迁徙、分化、细胞间相互作用以及细胞凋亡。黑色素瘤分化相关基因7／白介素24（MDA-7／IL-24）能选择性抑制瘢痕疙瘩中成纤维细胞的增殖,并诱导瘢痕疙瘩中成纤维细胞的凋亡,而对正常细胞无任何作用。MDA-7／IL-24很可能与瘢痕的形成有关。     

稳定高表达和干扰Nodal基因黑色素瘤细胞株构建及EMT表型鉴定

目的:构建稳定过表达及稳定干扰Nodal的黑色素瘤细胞B16细胞株,并鉴定其EMT表型,用于研究Nodal诱导黑色素瘤EMT的现象及机理。方法:将过表达小鼠Nodal基因的质粒pL-tdTomatomNodal,及携带有干扰Nodal基因序列的shRNA质粒pGFP-V-RS-Nodal,分别转染B16细胞。通过抗性筛选富集,阳性克隆挑选及扩大培养,获得稳定转染细胞株B16/dT-mNodal及B16/sh-Nodal。通过实时荧光定量PCR和Western blot技术检测胞内Nodal的过表达及敲除情况和EMT标记物的表达情况。结果:两株细胞均构建成功,B16/dT-mNodal细胞株发出强烈红色荧光,胞内Nodal水平上调明显,并呈现间质细胞特性;B16/sh-Nodal细胞株发出强烈绿色荧光,胞内Nodal水平下调明显,并呈现上皮细胞特性。结论:成功构建稳定过表达Nodal及稳定干扰Nodal的B16细胞株,并构建Nodal影响B16细胞EMT过程的模型,为研究Nodal在黑色素瘤EMT过程中的作用提供了重要的实验工具。     

G6PD通过细胞周期蛋白D1/D2调控人黑色素瘤细胞周期的进程

葡萄糖-6-磷酸脱氢酶(G6PD)在人皮肤黑色素瘤A375细胞中处于高表达与高活性状态, 但G6PD在黑色素瘤发生发展过程中的作用及其具体机制尚不明确.本文在前期运用 siRNA方法构建G6PD敲减的黑色素瘤A375稳转细胞(A375-G6PDΔ)基础上,构建表达载体pBabe-puro-G6PDWT在A375-G6PDΔ细胞中过表达野生型的G6PD基因,从而构建G6PD表达恢复的稳转细胞(A375-G6PDΔ-G6PDWT).3株细胞A375-WT、A375-G6PDΔ和 A375-G6PDΔ-G6PDWT经G6PD酶活性测定、MTT测定、克隆形成实验、流式细胞仪分析细胞周期和Western 印迹检测.结果显示,A375-G6PDΔ-G6PDWT细胞的G6PD蛋白表达量 (0.847 ± 0.080)及其活性(0.394 ± 0.029)分别是A375-G6PDΔ的3.28倍(P＜0.01) 和7.34倍(P＜0.01),分别是A375-WT细胞的91-57%和2.12倍(P＜0.05).与A375-WT细 胞相比,A375-G6PDΔ细胞G0/G1期细胞数增加,S期细胞数减少,增殖指数PI降低了25-70%（P＜0.05）,细胞周期蛋白D1/D2、细胞周期蛋白E表达分别下降37.4%、54.3% (P＜0.01)和17.3%;而A375-G6PDΔ-G6PDWT细胞呈现G1/S期阻滞解除,细胞周期蛋白D1/D2蛋白分别恢复到A375-WT细胞的89.5%和87.6%,细胞周期蛋白E表达未见 恢复,呈现生长增殖和克隆形成率的恢复并接近于A375-WT细胞. 结果提示,G6PD通 过细胞周期蛋白D1/D2调控人皮肤黑色素瘤A375细胞G1期向S期转换的进程,这为黑色 素瘤发病机制的研究提供了新的思路.     

靶向Ang2的RNAi慢病毒载体的构建及其对恶性黑色素瘤细胞中Ang2基因表达的影响

目的 构建携带促血管生成素2-小干扰RNA（Ang2-siRNA）慢病毒载体,观察其对恶性黑色素瘤细胞中Ang2基因表达的干扰作用.方法 将经XbaⅠ酶切电泳鉴定的带有加强绿色荧光蛋白的转移质粒（pNL-EGFP）载体与pSilencer 1.0-U6启动子-促血管生成素2-小干扰RNA（pSilencer 1.0-U6-Ang2-siRNA）重组质粒连接,产生加强绿色荧光蛋白的转移质粒-U6启动子-促血管生成素2-Ⅰ（pNL-EGFP-U6-Ang2-Ⅰ）、加强绿色荧光蛋白的转移质粒-U6启动子-促血管生成素2-Ⅱ（pNL-EGFP-U6-Ang2-Ⅱ）慢病毒转移质粒,电泳筛选阳性克隆,测序鉴定.用连接成功的慢病毒转移质粒、水疱性口炎病毒G蛋白（pVSVG）包膜质粒和pHelper包装质粒共转染293T细胞,产生pNL-EGFP-U6-Ang2-Ⅰ、pNL-EGFP-U6-Ang2-Ⅱ慢病毒.收集病毒上清,测定病毒滴度.将收集的病毒上清感染恶性黑色素瘤细胞,通过实时荧光定量RT-PCR测定抑制Ang2基因表达的效率.结果 酶切电泳与测序鉴定证实成功构建了Ang2-SiRNA慢病毒载体,293T细胞测定病毒原液滴度为8.0×103/ml.实时荧光定量RT-PCR结果显示：Ang2-siRNA慢病毒载体感染恶性黑色素瘤细胞,抑制了恶性黑色素瘤细胞中Ang2基因的表达（P＜0.05）.结论 成功构建了Ang2-SiRNA慢病毒载体,体外研究显示Ang2-SiRNA慢病毒载体能抑制恶性黑色素瘤细胞中Ang2 mRNA的表达,为下一步进行裸鼠恶性黑色素瘤移植瘤生长的干预实验奠定基础,为肿瘤的基因治疗提供实验依据.     

下调受体酪氨酸激酶样孤儿受体1表达对黑色素瘤B16F10生物学特性的影响

目的探讨下调黑色素瘤(melanoma)B16F10细胞中受体酪氨酸激酶样孤儿受体1(receptor tyrosine kinase like orphan receptor 1, ROR1)分子表达对其生物学特性的影响,为治疗黑色素瘤筛选候选靶标奠定基础。方法①以慢病毒载体介导shRNA下调B16F10细胞中ROR1的表达,并检测其下调效果;②CCK8法检测B16F10, Scrambled和Lv-shROR1-B16F10等3组细胞的增殖能力,再通过划痕实验和Transwell实验检测3组细胞的迁移能力,最后用流式细胞仪检测3组细胞的细胞周期;③将3组细胞接种到小鼠体内,观察小鼠的致瘤能力,并检测其致瘤效果。结果①经慢病毒感染后得到Lv-shROR1-B16F10和Scrambled两株细胞;②下调ROR1能够抑制细胞的增殖能力和细胞的迁移能力(P<0.05),使细胞停滞在G0～G1(P<0.05);③下调ROR1能抑制B16F10细胞的致瘤能力,瘤组织中ROR1的表达水平也降低(P<0.05)。结论 ROR1可参与黑色素瘤细胞的增殖、转移以及细胞的致瘤性,是一个有效治疗黑色素瘤的候选靶标。     

黑色素瘤患者血浆miR-21表达与临床病理特征的相关性

摘要 目的：探讨黑色素瘤患者血浆miR-21表达与临床病理特征的相关性。方法：2018年2月到2019年5月选择在本院诊治的黑色素瘤患者121作为黑色素瘤组,另选取同期良性皮肤肿瘤患者121例作为良性组。采集患者的空腹静脉血并提取血浆,采用qRT-PCR 技术检测血浆miR-21表达。调查患者的临床病理特征并进行相关性分析。结果：黑色素瘤组的血浆miR-21相对表达水平显著高于良性组(P<0.05)。在黑色素瘤组中,血浆miR-21相对表达水平与患者的年龄、性别、饮酒、肿瘤部位等无相关性(P>0.05),与临床分期、肿瘤转移、溃疡、吸烟等有显著相关性(P<0.05)。取miR-21诊断黑色素瘤的临界值(4.71),其诊断黑色素瘤的敏感性、特异性、准确性分别为77.6 %、87.0 %和81.7 %。logistic 回归模型分析显示吸烟、溃疡、miR-21表达水平都为影响黑色素瘤发生的重要因素(P<0.05)。结论：miR-21变化在黑色素瘤中呈现高表达,且与临床特征显著相关性,早期鉴别诊断黑色素瘤的预后效果比较好,同时有助于提高患者的生存率与生活质量。     

PMA 及乏氧诱导VEGF 上调的细胞模型构建及用于RNAi 研究

目的:探讨佛波酯(PMA)与乏氧诱导对小鼠黑色素瘤细胞B16-F10中血管内皮细胞生长因子(VEGF)表达量的影响,构建适合RNA干扰(RNAi)的体外细胞模型。方法:通过酶联免疫吸附试验(ELISA法)在蛋白质水平上检测细胞分泌的VEGF量,并用激光共聚焦显微镜观察小干扰RNA(siRNA)转染的细胞胞吞及细胞形态。结果:1 M PMA处理细胞2 h能明显上调B16-F10细胞中VEGF蛋白的合成及分泌,与常规培养相比,细胞可增加50%的VEGF水平。再经乏氧诱导48 h,稳定释放到培养液里的VEGF浓度大幅提高200%,范围在55-65 pg/mL/h。结论:经PMA和乏氧诱导后,B16-F10细胞稳定的VEGF分泌量与一定时间内分泌的稳定性均表明其适合作为RNAi的体外细胞模型。初步的RNAi结果表明,TKO/siRNA纳米粒与壳聚糖/siRNA纳米粒对于VEGF的沉默效率达40%。     

人X染色体含有一个黑色素瘤抗原基因亚家族

肿瘤相关基因的研究是肿瘤基因形成学说的核心内容。肿瘤相关基因家族的研究则是其中的重点和难点,从4－6月孕龄人胎肝cDNA文库中克隆到一个黑色素瘤抗原基因亚家族,称为MAGE－D亚家族,其成员包括3个直系同源体（人MAGE－D1、大鼠SNERG－1和小鼠DLXIN－1）和2个旁系同源体（人MAGE－D和人KIAA1114）。该家族的3个人类成员均定位于染色体Xp11.21-p11.23,同时具有独特的基因组结构。分子进化树分析表明,该家族与已知MAGE－A、－B和－C3个亚家族之间具有明显的进化上分歧。该亚家族的发现为研究肿瘤相关基因新功能提供了重要线索。