人源色氨酰tRNA合成酶H130R突变体的酶活和初步晶体学分析（英文）

色氨酰t RNA合成酶(tryptophanyl-t RNA synthetase,Trp RS)催化色氨酸的活化及其特异性t RNA的氨酰化,为蛋白质合成提供原料。在IFN-γ刺激下,人源细胞中的Trp RS通过结合血红素增强其氨酰化活性,以调节吲哚胺2,3-双加氧酶表达水平增高所引起的色氨酸缺失。体外研究发现,锌离子和血红素竞争性结合人源Trp RS以增强其氨酰化活性。然而,由于一个氨基酸位点H130R的突变,牛和鼠的Trp RS以及人的H130R突变体都不再受锌离子和血红素的影响,并具有高氨酰化活性。H130R Trp RS模拟了一种结合着锌离子或血红素的高活性构象,但目前还没有对这种构象的结构描述。为了阐明H130R决定Trp RS氨酰化活性种属特异性的原因,以及锌离子和血红素的结合位点,作者对人H130R Trp RS进行了活性分析和初步晶体学研究,此工作将为锌离子和血红素调节Trp RS氨酰化活性的机制研究奠定基础。     

肉鸭发酵床抗生素、重金属累积及细菌耐药性的演变特性

【目的】了解肉鸭发酵床使用过程中抗生素、各类金属元素累积特性,细菌抗生素耐受性演变特性。【方法】2011年11月至2013年7月,江苏某肉鸭发酵床养殖场饲养肉鸭期间,选取刚制作完成发酵床的鸭舍,和饲养4批次、8批次肉鸭时的鸭舍,检测发酵床中抗生素、金属元素含量,及发酵床中细菌的抗生素耐受水平。【结果】肉鸭发酵床垫料内强力霉素残留量因每批次肉鸭饲料中的使用而显著上升,氧氟沙星未现在垫料内累积。发酵床垫料饲养至8批次肉鸭时,垫料内耐受16、100μg/m L强力霉素三种可培养细菌的平均菌落数与比例为最高,而耐受8、50μg/m L氧氟沙星的平均菌落数、菌落数比例未现明显的增长趋势。发酵床使用过程中,垫料内As、Pb、Hg元素含量未显著增加,Cd元素检测量极低,Zn、Mn元素含量增加趋势明显,Cu、Cr元素累积速度缓慢。【结论】每批次使用强力霉素可在多批次肉鸭饲养后显著增加发酵床垫料中强力霉素含量,显著增强垫料中肠道菌群耐受强力霉素能力,Zn、Mn元素含量总体呈上升趋势。     

来源于铜绿假单胞杆菌(Pseudomonas aeruginosa)所产蛋白酶PT121克隆表达及其在小肽合成上的应用

【目的】基于前期筛选到的P.aeruginosa PT121所产有机溶剂耐受性蛋白酶,本研究对该蛋白酶进行克隆表达,研究了重组蛋白的酶学性质及小肽合成上的应用。【方法】参考文献中报道的相似蛋白酶pseudolysin设计引物从菌株PT121基因组中克隆到耐有机溶剂蛋白酶PT121基因las B。构建诱导表达重组质粒p ET22b-las B,于大肠杆菌中进行表达。考察蛋白酶PT121酶学性质及小肽合成上的应用。【结果】序列分析表明las B基因编码信号肽、前肽及成熟肽3个部分,成熟肽部分含有301个氨基酸,分子量约33 k Da,属于金属蛋白酶M4家族。通过破碎条件优化,一步法制备得到较为纯净的重组蛋白酶PT121,其比活力达7700 U/mg,该酶呈现了较高的热稳定性,p H稳定性及溶剂耐受性,与野生菌P.aeruginosa PT121所产蛋白酶性质一致。在50%DMSO体系中高效催化合成了多种小肽,其中阿斯巴甜前体(Cbz-Asp-Phe-NH2)产率高达91%。【结论】蛋白酶PT121基因在大肠杆菌中克隆表达为进一步研究相关催化机理及分子改造奠定了基础。     

六种蛋白酶酶解效果的研究

本实验利用六种蛋白酶(1、2、3、4、5、6号蛋白酶)分别对豆粕、玉米芽粕、花生粕、菜籽粕、酒糟、黄粉虫、地鳖虫进行酶解,以肽含量为指标研究六种蛋白酶的酶解效果.结果显示,3号蛋白酶对酒糟、黄粉虫、地鳖虫酶解效果明显,酶解液肽含量最高可达12.6 mg·L-1、17.66 mg· L-1和36 mg·L-1;4号蛋白酶对豆粕酶解效果明显,酶解豆粕肽含量达到17.47 mg·L一1;5号蛋白酶对花生粕酶解效果明显,酶解花生粕肽含量最高可达18.45 mg·L1;六种蛋白酶均能酶解菜籽粕,酶解液肽含量均在15 mg·L-1以上,且差异不大.     

马铃薯腐烂茎线虫L 型半胱氨酸蛋白酶新基因(Dd-cpl-1) 的克隆与序列分析

L型半胱氨酸蛋白酶基因 (Cathepsin L-like cysteine proteinase gene) 为与植物寄生线虫寄生能力相关的多功能基因。运用RT-PCR和RACE的方法从马铃薯腐烂茎线虫Ditylenchus destructor中克隆出1个L型半胱氨酸蛋白酶新基因Dd-cpl-1 (GenBank登录号为GQ180107)。该基因Dd-cpl-1 cDNA全长序列含有1个1 131 bp的开放性阅读框 (ORF),编码376个氨基酸残基,其5′末端及3′末端分别含有29 bp和159 bp的非编码区 (UTR)。Dd-cpl-1内含子外显子结构分析结果表明,其基因组序列包含7个内含子,且各内含子两端剪接位点序列遵守GT/AG规则。Dd-cpl-1基因推定的蛋白Dd-CPL-1与松材线虫L型半胱氨酸蛋白酶高度同源,一致性达到77％。以不同物种中L 型半胱氨酸蛋白酶氨基酸序列进行比对分析,推测推定的蛋白 Dd-CPL-1含有L型半胱氨酸蛋白酶基因家族高度保守的催化三联体 (Cys183,His322 和Asn343) 以及ERFNIN基系和GNFD基系。半胱氨酸蛋白酶系统发育分析表明,Dd-cpl-1 属于由L型半胱氨酸蛋白酶组成的进化分支。Dd-cpl-1的这些序列特征进一步表明其为L型半胱氨酸蛋白酶基因。这是首次在马铃薯腐烂茎线虫中克隆到的L型半胱氨酸蛋白酶,为今后在蛋白水平对其进行进一步的功能分析提供基础。     

高温强光对温州蜜柑叶绿素荧光、D1蛋白和Deg1蛋白酶的影响及SA效应

以3年生温州蜜柑（Citrus unishiu Marc.）植株为试材,用叶绿素荧光分析、Western-blotting蛋白质印记技术及DAB（3,3'-二氨基联苯胺）显色法,研究了高温强光（38℃和1600 μmol?m-2?s-1）对叶片叶绿素荧光参数、PS（光系统）II反应中心D1蛋白和Deg1蛋白酶的影响和SA（水杨酸）的效应。结果表明,高温强光交互作用4 h后,叶片的初始荧光Fo升高,最大光能转化效率Fv/Fm、表观光合电子传递速率ETR及PSII的量子产额ΦPSII显著降低,在D1蛋白降解的同时,Deg1蛋白酶含量也下降,并伴有H2O2的积累。在高温强光下,外源的H2O2使叶绿素荧光动力学快相参数(Fi-Fo)/(Fp-Fo)值（反映PSII中QB非还原中心的数量）升高和I-P的斜率（反映PSII 活化中心还原态QA积累的值）下降,Fv/Fm、ETR、ΦPSII及D1蛋白和Deg1蛋白酶下降幅度增大;而外源的SA使这些参数下降幅度减小。这些结果说明,高温强光诱导H2O2的积累造成Deg1蛋白酶和光系统反应中心D1蛋白的降解,Deg1蛋白酶的减少也进一步限制了D1蛋白的周转,进而使温州蜜柑PSII反应中心遭到破坏,SA对光合机构光破坏有保护作用。     

水杨酸对锌胁迫下小麦幼苗生长抑制的缓解效应

以小麦品种‘新麦18’为材料,采用室内水培实验研究了不同浓度水杨酸(SA)处理对300 mg.L-1锌胁迫下小麦种子萌发和幼苗生长的影响。结果表明:在Zn2+胁迫下,小麦种子的发芽势和发芽率、幼苗根长、芽长以及幼苗叶片的可溶性蛋白含量、根系活力显著降低,而脯氨酸和丙二醛(MDA)含量显著增加(P<0.05);外施SA显著提高了Zn2+胁迫下小麦种子的发芽势和发芽率,同时也使Zn2+胁迫7 d后的小麦幼苗的根长、芽长,幼苗叶片的脯氨酸和可溶性蛋白含量以及根系活力显著升高,膜脂过氧化产物MDA含量却显著降低(P<0.05)。由此可见,外施SA可通过提高小麦幼苗根长和芽长来增加幼苗根系活力,通过提高小麦幼苗可溶性蛋白含量、脯氨酸含量来维持细胞膜的稳定性,降低膜脂过氧化伤害程度,从而缓解了Zn2+胁迫对幼苗生长的抑制,并以14 mg.L-1外源水杨酸缓解效果最好。     

五种丛枝菌根真菌对枳实生苗耐锌污染的影响

通过盆栽实验研究丛枝菌根(AM)真菌Glomus versiforme(G.v)、G.mosseae(G.m)、G.intraradices(G.i)、G.aggregatum(G.a)和G.etunicatum(G.e)在锌污染条件下枳实生苗的菌根侵染、生长、叶片和根系锌、磷含量及部分生理指标的影响.结果表明:锌污染...     

蛋白酶产生菌LN01水解玉米黄粉蛋白的研究

玉米黄粉中含有约质量分数60%的蛋白质,但很难直接应用,必须进行预处理.本文以玉米黄粉为原料,利用蛋白酶产生菌LN01进行液体发酵,分别研究了液体接种量、初始pH、培养温度和培养时间等因素对LN01菌株水解玉米黄粉蛋白的影响.实验结果表明,LN01菌株水解玉米黄粉蛋白的最佳发酵条件为:初始pH值为6.0,液体种子接种量...     

冠状病毒PLpro蛋白酶对泛素样分子的DUB活性

SARS冠状病毒基因组中非结构基因nsp3编码的木瓜样蛋白酶 (PLpro) 在病毒基因组复制及逃避宿主天然免疫中发挥重要作用,是研发抗病毒药物的重要靶标．SARS冠状病毒PLpro是一种病毒编码的去泛素化酶 (DUB)．为深入研究SARS冠状病毒 PLpro对泛素样分子 (ubiquitin-like protein,UBL) 的DUB特性,本研究构建缺失 PLpro N末端泛素样结构域 (Ubl) 和下游跨膜结构域 (TM) 的PLpro构建体（constructs）,并构建3种缺失蛋白酶催化活性的突变体,检测PLpro对泛素样分子干扰素刺激基因15 (ISG15)及SUMO-1的作用．实验结果表明,PLpro和PLpro-TM 在细胞内具有很强的去ISG(DeISGylation) 活性;缺失PLpro N末端泛素样结构域(Ubl) 对PLpro 的去ISG15 活性没有影响;对PLpro蛋白酶活性位点C1651 和 H1812 突变后,PLpro-TM的去ISG15活性消失,而对D1826位点突变后不影响此活性．PLpro 不具有去SUMO (DeSUMOylation)活性,而PLpro-TM具有一定的去SUMO活性;PLpro催化活性相关的3个关键氨基酸残基 Cys-His-Asp突变后对去SUMO活性有一定的影响．研究结果提示,SARS PLpro除了具有DUB的活性,还具有体内去ISG活性和去SUMO活性;PLpro蛋白酶活性与其去ISG活性之间有一定相关性;PLpro去SUMO-1 活性具有TM 依赖性．SARS冠状病毒PLpro 对泛素样分子作用特性的研究为阐明病毒逃避宿主天然免疫机制和开发新型抗病毒药物提供重要的理论依据．