重组人源化抗CD52单克隆抗体N-糖糖型的分析方法的验证

目的 对重组人源化抗CD52单克隆抗体N-糖糖型的分析方法亲水相互作用液相色谱法进行方法学验证,并根据多批次产品的检测结果制定质量标准。方法 参考《中华人民共和国药典》2020版(三部)通则9101中相关要求及重组人源化抗CD52单克隆抗体的制造与检定规程,对单克隆抗体N-糖糖型的分析方法进行方法学验证,验证项目包括专属性、线性、准确度、精密度、范围和耐用性。对多批次重组人源化抗CD52单克隆抗体产品(≥15批)的N-糖糖型的检测结果进行分析,计算非岩藻糖及半乳糖的相对含量,确定质量标准。结果 空白对照、阴性对照对重组人源化抗CD52单克隆抗体N-糖糖型的分析无干扰;在60～300μg的抗体含量范围内线性良好,r²≥0.99;高、中、低3种抗体含量的回收率均在96%～106%;仪器进样重复性、样品制备重复性及中间精密度均良好,峰面积百分比及保留时间的RSD均≤5%;耐用性考察时各条件下的峰面积百分比及保留时间的RSD均≤5%。对多批次重组人源化抗CD52单克隆抗体的检定结果进行统计分析,确定N-糖糖型分析的质量标准为非岩藻糖相对含量4%～20%,半乳糖相对含量≥2...     

人巨细胞病毒的生物素DNA探针的制备和应用

本研究用克隆的HCMV AD169株DNA片段,制备了生物素标记的DNA探针,建立了检测临床脐带血、尿标本中HCMV DNA的核酸探针杂交方法。该探针可测出100pg同源DNA,不与人胚肺细胞、Hep-2细胞DNA以及其他疱疹病毒的DNA发生反应。用核酸杂交方法检测了30份脐带血标本,有11例阳性,阳性率为33％。10例孕妇尿标本中,3例阳性,阳性率为30％。检测结果表明：我们建立的生物素标记的HCMV DNA探针的点杂交法,具有高度的特异性、敏感性,比分离病毒法更迅速,可用于HCMV感染的临床标本的病毒核酸检测。     

我的虫友张保信先生

张保信先生是公元1932年8月生的,和我同岁。是我二十多年的虫友．记得第一次碰到他是1961年夏天的晚上．我和当时来台采集昆虫的白水隆博士(现为日本九州大学荣誉教授),在台北怀宁街的三时庄旅馆聊天时,他和另-一个人加入,而白水教授介绍得知他是这次和白水教授一起去采集的张保信先生．     

恒河猴(Macaca mulatta)卵细胞采集及体外受精的研究

对13头成年母猴,用黄体酮 前列腺索(PGF_(2a))处理,诱发月经周期,并用三种不同的处理方案,注射外激性促性腺激素诱发等超数排卵。对171个大滤泡(直径≥4mm)实行外科手术采卵,滤泡穿刺吸卵共获147个卵细胞,平均每头猴采卵11.31±6.47个,卵细胞回收率为85.96％。精液用直肠电刺激法采集,精子经TALP培养基洗涤二次,并在含10％灭活猴血清的TALP液中,加入1mM CAMP和lmM咖啡因,预孵育6～3h。卵细胞在含10％灭活猴血清的TALP或Ham'sF-10培养基中作体外成熟的培养,经约4～12h孵育,卵细胞体外成热率为28.57％。成熟的卵细胞(n=42,中期Ⅱ)和已预孵育的精子一起12～24h,并有部分在前次输精后5～12h再次输精,在42～56h后有9个受精卵继续发育至2细胞期和桑椹期阶段,体外受精率为35.71％(15/42)。     

人巨细胞病毒对单纯疱疹病毒1型抗原表达的影响

我们用免疫胶体金色埋前标记技术和免疫荧光技术研究了人胚肺细胞(HEL)内,人巨细胞病毒(HCMV-AD_(169))对单纯疱疹病毒1型(HSV-ⅠSM_(44))抗原表达的影响,旨在探讨在细胞这一微生境内,一病毒对另一病毒可能发生的影响。电镜下计数HSV-1组和HCMV HSV-1组特异性结合金颗粒数得HSV-1组为657个,HCMV HSV-1组的总数为283个。t检验P<0.01,差别非常显著。并且HSV-1组细胞的胞浆中的病毒颗粒,比HCMV HSV-1组明显多。荧光显微镜下:HSV-1组阳性细胞数为689个HCMV HSV-1组只有484个,经poisson分布u检验,P<0.01,差别非常显著。免疫荧光实验还表明:HSV-1组,抗血清在1:320时仍有荧光清晰的阳性细胞,而HCMV HSV-1组,抗血清在1:160时,却无荧光阳性细胞。细胞病变效应(CPE)动态观察显示:HSV-1组8小时即有细胞病变,24小时蔓延整个单层;而HCMV HSV-1组超感染14小时才有细胞病变。24小时约有75％细胞受累。结果表明HCMV对HSV-1的抗原表达有明显的抑制作用。对抑制作用的可能机理及其在分子生态学中的意义,进行了讨论。     

抗人IgG Fc片段及Fab段单抗的鉴定及应用

本实验采用木瓜酶水解,SPA柱亲合层析等手段得到人IgGFc段及Fab段,以Sigma抗人IgGfFc段和抗人IgG Fab段单抗为标准品,鉴定了细胞库中抗人IgG系列的部分细胞株,得到特异性分泌抗人IgG Fc段和抗人IgG Fab段单抗的细胞各一株。 在上述实验基础上,用抗人IgG Fc及抗人IgG Fab单抗分别制备了Sepharose4B亲合层析柱,提纯了酶解人IgG Fc、Fab片段,经ELISA法鉴定,相互之间无交叉反应。同时用此方法制备了人抗HBe Fab片段,并将该片段进行了过氧化物酶标记,用来配制HBe ELISA诊断盒,证明其生物活性未受影响,而且消除了类风湿因子引起的HBe Ag假阳性现象。因抗HBe单抗来源困难,如采用HBe多抗制备ELISA试剂,本法将是提高质量的一个好方法。     

用胰酶转肽的方法使人胰岛素原转成人胰岛素

猪胰岛素胰酶转肽成人胰岛素的相似条件下,基因工程生产的人胰岛素原可以50％的产率转成人胰岛素,所得人胰岛素的氨基酸组成与理论值相符,并具有天然活力。     

249个氨基酸的人胰岛素原融合蛋白的表达

选Tac启动子,构建了以牛凝乳酶原B前161个氨基酸的多肽基因与人胰岛素原基因的融合基因的表达质粒pJG202,转化大肠杆菌JMl05,表达受IPTG及温度诱导。高表达时,按电泳扫描计算,表达的融合蛋白可占细胞总蛋白的20－35％。经CNBr裂解,S－磺酸解,初步分离S－磺酸型的人胰岛素原后再使之重组,可分离得人胰岛素原纯品,其氨基酸组成、生物活性与人胰岛素原标准相同。     

人尿激酶原cDNA在中国仓鼠卵巢细胞(CH0)中高效表达研究

通过构建高效表达载体,改进转染方法,与二氢叶酸还原酶(dhfr)基因共扩增等手段在CH0细胞内高效表达了人尿激酶原(Pr0-UK)cDNA。首先将pro—UK cDNA插入到sR α启动子的下游,构建成表达质粒pMGl0102,在cos－7细胞内进行暂时性表达,结果表明此启动子的表达水平比SV40早期启动子高约5倍。然后将质粒pMG10102和pSV2－dhfr线性化后用磅酸钙共沉淀法转染CH0－dhfr-细胞,经一系列筛选后获得20个能表达pro—UK的细胞克隆,纤维蛋白溶解平板法(FAPA)测定表达水平为12．5—100IU／10⁶cells／d．再经MTX加压共扩增,得到9株高表达细胞系,其中最高的表达水平达到400—500Iu／10‘cells／d。2—3个月连续传代,表达水平未下降,表明细胞株是稳定的。Western Blot分析证明细胞分泌的重组pro－UK具有与天然pro—UK相同的分子量,而且培养液中不加蛋白酶抑制剂时,分泌的重组UK大部分为单链(60％以上)。