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51.
随着基因工程研究的发展,近年来酵母质粒作为基因工程载体的研究已获得明显进展。因此,开展酵母质粒DNA快速检测方法的研究,将是很有意义的。目前质粒在啤酒酵母(Saccharomyces cerevisiae)中研究较多。1982年龚启蕙等报道了啤酒酵母7209—1A及1984 相似文献
53.
54.
将苏云金芽孢杆菌中的pHTA1030质粒与大肠杆菌中的pJH101质粒重组后,构建出pBHGA重组质粒。此质粒通过逐步酶切,缺失后重组得到了14个分子量大小不同的衍生重组质粒。经过对pBHG1重组穿梭质粒在E.coli HB101和B.subttlis 168受体中表达的分析,证明了它带有B.thuringiensis(简写作B.t.)质粒的启动区、启始复制区和对热分离稳定区基因片段,并能高频转化B.t.受体细胞和高表达外源cat基因,同时具有对热分离稳定的特性。为B.t.基因工程体系提供了高效转化表达载体。 相似文献
55.
张静娟 《中国生物工程杂志》1982,2(1):3-6
一、Ti质粒的发现 根癌病土壤杆菌是引起许多植物(据文献记载有83属300余种)冠瘿(crown gall)肿瘤的病原体。有关它的研究是从1907年Smith和Townsend提出该病的病原学开始的,40年代While和Braun等人用无菌冠瘿组织证明肿瘤的发生基于肿瘤基因的转化以后,吸引了越来越多的人去进行这种基因的分离和转化研究。特别是60年代,Schilpcroort等人用免疫学和分子杂交的技术,在无菌冠瘿细胞中分别测到了细菌的抗原和细菌Ti质粒的DNA序列以后,这方面的文章更是指数地增加。 相似文献
56.
摘要 目的:构建筛选人源靶向特异PINK1-shRNA敲减质粒,转染神经母细胞瘤SH-SY5Y细胞并验证该质粒转染后对PINK1基因的敲减效率,观察对细胞线粒体形态的影响。方法:构建两对人源PINK1-shRNA序列(编号分别为PINK1-shRNA-39和PINK1-shRNA-42),将这2对干扰序列连接在载体上形成重组载体,经测序验证后,将空载体和两对敲减质粒分别转染SH-SY5Y细胞,获得基因敲减的细胞模型,用CCK-8法检测细胞的存活率,用荧光定量PCR方法确定PINK1基因的敲减效率,用蛋白质免疫印迹法验证细胞内PINK1的表达水平是否发生改变,用激光共聚焦显微镜观察线粒体的形态是否发生了改变。结果:我们提取的质粒,经测序结果显示,质粒载体构建成功;转染细胞后,CCK-8 法检测细胞存活率发生了降低,与正常组比较,PINK1-shRNA-39和PINK1-shRNA-42敲减质粒组,细胞的存活率分别降低了13.7%(P<0.05)和14.1%(P<0.05);荧光定量PCR结果显示,与正常组相比,PINK1-shRNA-39组和PINK1-shRNA-42组敲减质粒转染的细胞内PINK1基因的表达分别降低了24.1%(P<0.01)和36.7%(P<0.01);蛋白质印迹法结果显示,与正常组相比,两对质粒分别转染细胞后,PINK1-shRNA-39和PINK1-shRNA-42敲减质粒转染的细胞内PINK1蛋白的表达水平降低,差异有统计学意义(P<0.01),PINK1-shRNA-42敲减质粒转染的细胞内PINK1蛋白的表达水平有效降低更明显;与正常组比较,激光共聚焦显微镜观察到基因敲减两组细胞的线粒体部分发生断裂,碎片较多,基因敲减两组的线粒体的形态因子显著降低,差异有统计学意义(P< 0.01)。结论:成功构建了人源的PINK1基因敲减的质粒,并将敲减的质粒成功转染至SH-SY5Y 细胞中,细胞内PINK1基因的mRNA和蛋白的表达水平降低,且细胞线粒体的形态发生了改变。 相似文献
57.
旨在利用CRISPR/Cas9技术构建敲除花生四烯5-脂氧合酶基因(Arachidonate 5-lipoxygenase gene,ALOX5)的重组质粒。设计合成3对靶向敲除ALOX5第六外显子的sgRNA,将其分别插入到CRISPR/Cas9质粒骨架pX458载体中,转化感受态大肠杆菌DH5α后挑取克隆,通过测序评估重组质粒是否构建成功。将构建好的重组质粒转染293T细胞,在荧光显微镜下观察转染效果,挑取转染成功的细胞,用试剂盒提取转染细胞基因组DNA,PCR扩增含敲除位点的DNA片段,用测序技术获得核苷酸序列,用DNAStar软件分析转染细胞中ALOX5基因敲除情况。测序结果表明2对双链sgRNA寡核苷酸已插入质粒,且序列正确,靶向ALOX5基因的重组质粒pX458-sgRNAs-ALOX5构建成功。其在293T细胞中的转染效率约为50%,用一代测序法未检测到sgRNAs的切割效果。初步表明利用CRISPR/Cas9技术成功构建靶向ALOX5基因的重组质粒pX458-sgRNAs-ALOX5。 相似文献
58.
为了筛选出酶联免疫吸附测定 (Enzyme linked immunosorbent assay,ELISA) 反应性最佳的非洲猪瘟病毒 (African swine fever virus,ASFV) 诊断抗原,通过建立ELISA方法,以杆状病毒昆虫细胞表达系统表达的ASFV p30蛋白诊断抗原为参照,首次探讨原核表达系统表达的ASFV p35蛋白作为诊断抗原的抗原性和潜力。免疫印迹和免疫荧光结果表明,获得了40 kDa的重组p35蛋白和30 kDa的p30蛋白,两种蛋白与ASFV阳性血清均具有较好的免疫反应原性。采用重组p30和p35蛋白作为诊断抗原分别建立ELISA方法,并验证其敏感性、稳定性以及与进口试剂盒的符合率。结果显示,尽管p35-ELISA方法的检测敏感性稍低于p30-ELISA方法,但其敏感性仍可达95.8%,且p35-ELISA方法和p30-ELISA方法的批内和批间变异系数均小于10%。p35-ELISA方法与进口试剂盒比较,符合率达97.2%。结果表明建立的p35-ELISA方法敏感性高且稳定性好,可应用于ASFV感染血清的检测。 相似文献
59.
60.
实时定量PCR构建法夫酵母内参基因β-actin、 gpd、18S rRNA标准品质粒和标准曲线 总被引:1,自引:0,他引:1
为建立检测法夫酵母JMU-MVP14中虾青素合成相关基因在不同生长时期表达水平的实时定量PCR方法,构建法夫酵母JMU-MVP14的管家基因β-actin、gpd、18S rRNA的标准质粒,进行实时定量PCR,制作标准曲线及回归方程.β-actin基因标准曲线相关系数(R2)=0.9956,扩增效率(E) =96.93%;gpd基因标准曲线相关系数(R2) =0.9901,扩增效率(E) =93.78%;18S rRNA基因标准曲线相关系数(R2) =0.9981,扩增效率(E)=98.76%.3个基因片段的熔解曲线均呈单峰;扩增曲线呈典型的S型动力学曲线,指数期和平台期明显,为理想的熔解曲线和扩增曲线.用geNorm软件对三个管家基因的稳定性进行分析,三个基因的稳定性排序为β-actin> 18S rRNA> gpd,故β-actin和18S rRNA较适合作为研究法夫酵母JMU-MVP14定量实验的内参基因. 相似文献