基于壳聚糖结合模块构建新型酿酒酵母孢子表面展示系统

【目的】基于当前细胞表面展示体系存在的问题,旨在构建一个新型的普适性强、抗逆性好、高效稳定的酿酒酵母孢子表面展示系统。【方法】首先,根据酵母孢子固定化酶的特性,通过查阅文献寻找潜在的与孢子壁壳聚糖层高度亲和的壳聚糖结合模块;其次,利用绿色荧光蛋白(green fluorescent protein,GFP)与结合模块融合表达,在体外和孢子内分别验证结合模块与孢子壁的亲和能力;之后,选择Saccharomyces cerevisiae AH109来源的α-半乳糖苷酶(α-galactosidase,MEL1)评估新型展示体系的效能。【结果】首先,选择Paenibacillussp. IK-5来源壳聚糖酶的碳水化合物结合模块32 (carbohydrate binding module 32,CBM32)作为壳聚糖结合模块。其次,将大肠杆菌表达纯化后的融合蛋白CBM32-GFP与dit1Δ孢子共孵育,通过GFP荧光定位以及荧光强度验证CBM32在体外与孢子壁具有较好的亲和能力;CBM32-GFP在dit1Δ孢子内的荧光定位与结合能力证明了其在孢子内能够与孢子壁紧密结合;最后,以MEL1替换GFP应用到新型展示体系中,与只表达MEL1的孢子相比,CBM32-MEL1孢子酶活不仅提高了68.65%,最高酶比活力达到460.59 U/g DCW (dry cell weight, 菌体干重),重复使用能力也得到了显著提高;此外,该体系提高了MEL1的稳定性和可操作性。【结论】本研究首次提出利用结合模块来构建一个新型酿酒酵母孢子表面展示体系,为真核来源的多糖基化位点修饰以及多亚基结构蛋白提供了可靠的细胞表面展示平台,为实现工业化应用孢子固定化酶提供了理论依据。     

蔗糖异构酶PalI在解脂耶氏酵母中的表面展示

【背景】蔗糖异构酶(PalI)生物转化蔗糖是目前生产异麦芽酮糖的主要方法,但在生产过程中存在的蔗糖异构酶转化蔗糖副产物比例较高、游离酶需要分离纯化等问题限制了异麦芽酮糖工业生产的应用。【目的】构建蔗糖异构酶PalI在解脂耶氏酵母(Yarrowia lipolytica) Po1g中的表面展示菌株,以降低蔗糖异构酶转化蔗糖的副产物比例及其纯化成本。【方法】为获得具有生产PalI能力的Y.lipolytica Po1g表面展示菌株,通过重叠延伸PCR将克雷伯氏菌(Klebsiella singaporensis)LX3的PalI的编码基因PalI与全基因合成的来自Y.lipolytica细胞壁的锚定蛋白Pir1融合,转入Y.lipolytica Po1g中构建表面展示菌株。利用3,5-二硝基水杨酸(3,5-dinitrosalicylic acid,DNS)比色定糖法测定表面展示的PalI酶活力并对其酶学性质进行探究,通过高效液相色谱法分析其转化蔗糖的产物。【结果】构建了蔗糖异构酶表面展示菌株Pir1-PalI/Po1g,经DNS法测得展示在Y. lipolytica Po1g表面的Pal...     

XCR1与CXCR4形成异源二聚体并调控其内化

趋化因子及其受体信号通路是肿瘤细胞转移的主要调控因素之一,趋化因子受体CXCR4和XCR1都被证明参与了乳腺癌的进展。本文基于膜蛋白酵母双杂交发现了XCR1-CXCR4这一尚未报道过的相互作用对,进一步通过生物发光共振能量转移技术(bioluminescence resonance energy transfer, BRET)验证并发现XCR1可以竞争性地结合CXCR4受体 (P<0.01),形成异源二聚体。在功能方面,首先通过XCR1和CXCR4瞬时转染HEK293细胞进行划痕实验,加入30 nmol/L SDF-1β后,共转组41.55%的伤口愈合率低于单转CXCR4组的58.75%,说明XCR1的共表达抑制了基质细胞衍生因子-1β(SDF-1β)/ CXC趋化因子受体4型 (CXCR4)信号通路介导的细胞运动性(P<0.05);其次,利用CXCR4-EGFP转基因HEK293细胞系,共表达XCR1后,流式细胞术检测细胞表面CXCR4受体荧光。结果显示,在30 nmol/L SDF-1β的诱导下,XCR1能够加速异源二聚体中CXCR4的内化 (P<0.05),使得内化率从14.38%上升到64.10%;最后,分别检测了控制细胞增殖的Akt和控制细胞迁移的ERK信号通路的变化。结果发现,在SDF-1β刺激10 min后,单转CXCR4组的ERK磷酸化为3.59倍,而共转染XCR1/CXCR4组ERK的磷酸化水平仅为2.08倍,二聚化使得ERK磷酸化水平下降,且激活时间缩短;而Akt的磷酸化水平几乎不受影响。本研究揭示了CXCR4和XCR1二聚化现象,以及该二聚体对CXCR4介导的细胞运动性、受体内化和ERK磷酸化的影响。提示靶向XCR1的药物可以成为CXCR4交叉脱敏的候选药物,对于抑制乳腺癌转移提供了一个可供选择的思路。     

盐离子作用下组蛋白变体H2A.Z增强核小体结构的稳定性

真核生物染色质的基本结构组成单元是核小体,基因组DNA被压缩在染色质中,核小体的存在通常会抑制转录、复制、修复和重组等发生在DNA模板上的生物学过程。组蛋白变体H2A.Z可以调控染色质结构进而影响基因的转录过程,但其详细的调控机制仍未研究清楚。为了比较含有组蛋白变体H2A.Z的核小体和常规核小体在盐离子作用下的稳定性差异,本文采用Förster共振能量转移的方法检测氯化钠、氯化钾、氯化锰、氯化钙、氯化镁等离子对核小体的解聚影响。实验对Widom 601 DNA序列进行双荧光Cy3和Cy5标记,通过荧光信号值的变化来反映核小体的解聚变化。Förster共振能量转移检测结果显示:在氯化钠、氯化钾、氯化锰、氯化钙和氯化镁作用下,含有组蛋白变体H2A.Z的核小体解聚速度相比于常规核小体要慢,且氯化钙、氯化锰和氯化镁的影响更明显。电泳分析结果表明,在75℃条件下含有组蛋白变体H2A.Z的核小体的解聚速率明显低于常规核小体。采用荧光热漂移检测(fluorescence thermal shift analysis , FTS)进一步分析含有组蛋白变体H2A.Z核小体的稳定性,发现两类核小体的荧光信号均呈现2个明显的增长期,含有组蛋白变体H2A.Z核小体的第1个荧光信号增速期所对应的温度明显高于常规核小体,表明核小体中H2A.Z/H2B二聚体的解聚变性温度要高于常规的H2A/H2B二聚体,含有组蛋白变体H2A.Z核小体的热稳定性高。研究结果均表明,含有组蛋白变体H2A.Z的核小体的结构比常规核小体的结构稳定。     

外源脯氨酸对自然干旱下白刺叶片气孔的影响

以大田环境内多年生荒漠植物白刺（Nitraria tangutorum）为研究对象,采用扫描电子显微镜对不同外源脯氨酸质量浓度处理下白刺叶片气孔进行微观结构观察并测定叶片表皮气孔器长度、宽度、面积和密度,比较同一指标在不同脯氨酸质量浓度处理下的差异。采用室外试验研究自然干旱胁迫下喷施质量浓度为50、100、150、200、250 mg·L^-1的外源脯氨酸（Proline,缩写为Pro或P）研究白刺的耐旱性。观察结果显示,白刺叶片气孔保卫细胞为肾形,气孔在叶片表皮随机分布,气孔器多为无规则型,气孔呈椭圆形且叶片表面蜡质较少,并且叶片细胞出现褶皱和下陷。与对照相比,在不同质量浓度处理和不同采样时间时,气孔长度、宽度及面积下降,气孔密度增大,随着浓度的升高以及采样时间的变化,气孔长度整体呈现下降趋势,当浓度达到200 mg·L^-1时,下降幅度增大,宽度和面积整体呈现先降低后升高再降低的趋势,而气孔密度则整体呈现上升趋势,其中,气孔长度、宽度和面积在质量浓度为50 mg·L^-1、采样第1天时达到最大值,气孔密度在质量浓度为150 mg·L^-1、采样第9天时达到最大值。此外,气孔长度在不同浓度脯氨酸处理下第1、6和9天存在显著差异,而气孔宽度和面积差异不显著,除第0天外,气孔密度因脯氨酸质量浓度不同均差异显著（P<0.05）。研究结果表明,自然干旱胁迫下对白刺叶片喷施不同质量浓度的外源脯氨酸,可减小气孔长度、宽度和面积,而增加气孔密度,以期为白刺抗旱提供理论依据。     

消癌平诱导caspase-3活化动态过程的实时监测

消癌平是从萝摩科(Asclepiadaceae)植物通关藤(Marsdenia tenacissima)根部提取的药物,已经广泛应用于癌症和多种炎症的临床治疗,并且具有较好的疗效。将消癌平注射液与细胞培养液按照1∶1的比例混合后共同培养人肺腺癌(ASTC-a-1)细胞,通过CCK-8方法检测发现消癌平能够显著抑制细胞的增长。然后利用荧光共聚焦扫描显微镜和荧光共振能量转移(fluorescence resonance energy transfer,FRET)技术在稳定表达了SCAT3质粒的单个ASTC-a-1细胞中实时动态监测消癌平处理后SCAT3的空间分布以及SCAT3被caspase-3切割的动态过程。实验结果表明:消癌平处理后20 min中SCAT3开始向细胞核以及细胞膜部位转移,约在100min左右SCAT3被迅速切割。     

水稻白叶枯病菌中超氧阴离子的非酶来源分析

以电子自旋共振法及羟胺氧化法检测超氧阴离子,分析水稻白叶枯病原细菌OS-14细胞中超氧阴离子的来源。结果显示,OS-14细胞中的超氧阴离子释放活性主要位于胞外,因此胞外组分很可能为主要的释放位点。实验从多个角度排除了胞外组分中蛋白质酶类分子对超氧阴离子释放贡献的可能性,有机酸分子有可能是水稻白叶枯病菌OS-14细胞胞外组分中超氧阴离子释放的非酶分子。     

白念珠菌生物膜与侵袭及耐药

为了解近年来白念珠菌(Candida a lbicans)表面生长及生物膜形成研究的动向和进展,本文从几个方面阐述了白念珠菌表面生长和生物膜形成的生理病理学及其抗真菌耐药性的特征。包括白念珠菌宿主表面黏附、菌丝转换基因、微菌落定量感触调节、外分泌酶降解作用、菌丝地形趋向性和抗真菌耐药形成机制。结论提示,白念珠菌生物膜形成是其表面生长的重要结构,是临床上医疗植入物发生血源性白念珠菌感染传播的主要诱因,也是抗真菌耐药形成的重要因素,具有重要的病理学和生物学意义。     

类金刚石薄膜的制备及其血液相容性的初步研究

本文以单晶硅为基体,Ar等离子体对基体进行清洗,用法制备类金刚石(DLC)膜和掺氮的DLC膜。沉积DLC膜所用的气体是乙炔和氩气,沉积掺氮的DLC膜用乙炔和氮气。利用衰减全反射红外光谱(ATR-FTIR)和扫描电子显徽镜(SEM)对沉积的DLC膜和掺氮的DLC膜进行结构分析和观察表面形貌。考察了乙炔比例、放电功率等沉积参数对DLC膜的影响。通过接触角和血小板黏附实验,进行了DLC膜的抗凝血性能分析,效果较好。     

外源表位在Salmonella菌毛上的表达

过去的20年中,在细菌表面展示外源多肽的表达系统的研究取得了重要进展。而其中相当一部分是以细菌菌毛作为表达载体用于表达外源多肽或蛋白。本文将详述一种特殊的利用基因置换构建的沙门菌菌毛外源多肽展示系统,同时介绍一些其他的菌毛展示系统并探讨他们的优劣性。