基于纳米颗粒的赭曲霉毒素A高灵敏酶联免疫检测方法的建立及应用

赭曲霉毒素(ochratoxins)主要是由青霉菌Penicillium和曲霉菌Aspergillus产生的有毒次级代谢产物,常见于发霉或发酵的农产品中,其中赭曲霉毒素A(ochratoxin A,OTA)毒性最强且最为普遍。OTA是粮食作物和饲料的重要污染物,在加工、储存或运输过程中均可产生,具有肾毒性和免疫毒性,可通过蓄积作用发挥毒性效应,对人类和动物健康造成严重威胁。本研究通过将OTA单克隆抗体包被于纳米磁珠(magnetic nanoparticles,MNPs)表面,获得具有免疫活性的磁珠抗体复合物(MNPs-Anti OTA),并制备生物素标记的偶联抗原OTA-BSA-Bio,后续采用链酶亲和素标记的纳米金颗粒(Strep-HRP-AuNPs)催化底物进行信号检测,最终建立了OTA高灵敏检测方法(MNPs-bs-AuNPs-ELISA)。在最优条件下,经计算该方法检测下限(IC10)为0.01ng/mL,检测区间(IC20-IC80)为0.02-0.73ng/mL,半数抑制率(IC50)为0.13ng/mL。与OTA类似物OTB、OTC交叉反应性为4.3%和8.1%,对其他常见真菌毒素AFB1、ZEN、FB1、DON、CIT和PAT均无交叉反应。玉米、面粉和大豆样本中的加标回收率可达85.6%-115.7%,对天然样本中OTA含量的检测结果表明,该方法与LC-MS/MS相关性良好。本研究建立的MNPs-bs-AuNPs-ELISA可满足谷物及饲料样本中OTA的快速、高灵敏度定量检测,成本较低,具有很好的应用前景。     

假结核耶尔森氏菌中Phd-Doc毒素-抗毒素系统的功能鉴定

【背景】毒素-抗毒素系统在微生物体内广泛存在,在微生物对抗外界不良环境方面发挥重要作用。【目的】以模式细菌假结核耶尔森氏菌(Yersinia pseudotuberculosis,Yptb)为材料,探究其编码的Phd-Doc毒素-抗毒素系统的作用机制和生物学功能。【方法】通过生物信息学方法预测Yptb中编码的Phd-Doc毒素-抗毒素系统,通过毒性分析、基因表达分析及蛋白相互作用对其进行鉴定;通过抗生素胁迫、氧胁迫、生物被膜形成等实验研究Phd-Doc在体内发挥的生物学功能。【结果】生物信息学分析鉴定出一对Phd-Doc毒素-抗毒素系统,发现二者共转录且相互作用;毒素蛋白Doc能够引起大肠杆菌形态发生变化并抑制其生长,抗毒素蛋白Phd能中和Doc的毒性;Phd-Doc毒素-抗毒素系统具有自调控抑制效应;phd-doc的缺失对Yptb自身的生长无影响,而且毒素蛋白Doc在野生型Yptb内过表达并未显示毒性;phd-doc在转录水平上响应了抗生素胁迫和氧胁迫,其中,对氯霉素胁迫最为敏感,但并不影响Yptb的生长;同时,Phd-Doc能够影响Yptb的生物被膜形成能力。【结论】Yptb中Phd-Doc毒素-抗毒素系统的功能鉴定对于更好地了解在多变的外部环境下微生物的定殖和响应机制具有重要意义。     

氯毒素用于神经胶质瘤治疗的研究进展

氯毒素是一种从以色列沙漠蝎的毒液中分离出来的多肽,它具有稳定和紧凑的三级结构,可以抑制胶质瘤细胞的增殖、转移和侵袭,并且可作为靶向剂结合显影剂和药物等用于胶质瘤细胞的治疗。本文就对氯毒素在脑胶质瘤治疗中的研究和应用进展方面作一综述。     

间斑寇蛛卵粒毒素-Ⅵ的基因克隆、异源表达与活性鉴定

间斑寇蛛Latrodectus tredecimguttatus的一个显著特点是其毒腺外组织甚至卵粒中也存在毒性成分。研究毒腺外的毒素不但可以加深对蜘蛛毒素的了解,而且可以发现具有重要应用前景的新型毒素分子。为了探究间斑寇蛛卵粒中低丰度表达的蛋白质类毒素,利用生物信息学方法从间斑寇蛛卵粒转录组中挖掘出一条编码多肽毒素的基因序列,利用基于3′-RACE和巢式PCR的策略成功克隆并异源表达了该基因。表达的多肽毒素命名为间斑寇蛛卵粒毒素-Ⅵ(Latroeggtoxin-Ⅵ,LETX-Ⅵ)。生物学活性鉴定结果表明,LETX-Ⅵ能抑制ND7/23细胞膜上的钠离子通道电流和促进PC12细胞多巴胺的释放,但对美洲蜚蠊Periplaneta americana和金黄色葡萄球菌及白色念珠菌等细菌和真菌不显示明显的毒性,说明LETX-Ⅵ是一种哺乳动物特异的神经毒素,在神经生物学研究工具试剂和相关疾病治疗药物的研发等方面具有潜在的应用前景。     

蜡样芽胞杆菌族毒素研究进展

蜡样芽胞杆菌族（Bacillus cereus sensu lato）包括几个具有密切系统发育关系的芽胞杆菌物种,产生的毒素种类繁多,备受人们关注。质粒在菌株中的水平转移,会改变其表型、致病性和毒力,同时也带来分类的问题。通过综述几种蜡样芽胞杆菌毒素的结构特性、作用机制及其危害或生物应用,从质粒水平转移的角度介绍蜡样芽胞杆菌族成员错综复杂的关系。     

Thr28突变对虎纹捕鸟蛛毒素-Ⅳ钠通道活性的影响

虎纹捕鸟蛛毒素-Ⅳ(HWTX-Ⅳ)是从虎纹捕鸟蛛粗毒中分离纯化到的一种新型多肽类神经毒素,能明显抑制表达于大鼠背根神经节细胞的河豚毒素敏感型(TTX-S)钠通道.为了更好地研究该毒素的结构与功能之间的关系,采用芴甲氧羰基(Fmoc)固相多肽化学合成法合成了用谷氨酸(Glu)替代HWTX-Ⅳ第28位苏氨酸残基的突变体T28D-HWTX-Ⅳ,线性多肽合成产物经反相高效液相色谱(HPLC)分离纯化后进行谷胱甘肽氧化复性.复性产物采用基质辅助激光解析飞行时间质谱(MALDI-TOF/TOF MS)技术鉴定分子质量,通过全细胞膜片钳电生理技术测定其电压门控钠通道药理学活性.当第28位Thr残基被Glu取代后,突变体T28D-HWTX-Ⅳ对表达于大鼠DRG细胞膜上的TTX-S钠通道的IC50值约为362 nmol/L,对TTX-S钠通道的抑制活性比天然HWTX-Ⅳ(IC50值=30 nmol/L)下降了约12倍,显示第28位的Thr残基是HWTX-Ⅳ与TTX-S型钠通道相互作用的关键活性残基.目前的研究为进一步探索HWTX-Ⅳ的结构与功能关系及新型镇痛药物的研发奠定了基础.     

应用改构的炭疽毒素作为靶向肿瘤细胞的药物递送系统及其效果评价

目的:通过改造炭疽毒素保护性抗原Protective Antigen (PA)及致死因子Lethal Factor (LF),尝试建立更加广谱的新型炭疽毒素靶向给药系统并对其递送效率进行定量评价.方法:采用基因工程手段,分别构建了3种改构的天然炭疽毒素保护性抗原PA及炭疽毒素的LF N端融合海肾荧光素酶(Luciferase)的LFn-linker-Luc的大肠杆菌重组表达体系.利用CCK-8法评价改构PA和LF共同作用肿瘤细胞后的细胞存活率;利用改构PA和LFn-linker-Luc与肿瘤细胞共孵育,通过测定细胞内荧光素酶活性,评价改构PA靶向肿瘤细胞的效果.结果:体外酶解实验证明构建的改构PA蛋白能够被正确地酶解成目的大小的片段;改构PA和LF共同作用肿瘤细胞能够显著降低细胞存活率;利用LFn-linker-Luc能够评价改构PA的靶向效率,PA蛋白的改构方式与其递送效率相关.结论:设计并改构的炭疽毒素药物递送系统,能够实现特异性靶向肿瘤细胞的效果,并具有更广谱的作用效果,为研制新型广谱抗肿瘤药物提供了新的思路和方法.     

微嗜酸寡养单胞菌中的漆酶对黄曲霉毒素B1降解脱毒的生物活性

【目的】探究微嗜酸寡养单胞菌中的漆酶对AFB1的降解活性,并确定漆酶在菌株CW117降解代谢AFB1过程中的贡献。【方法】从微嗜酸寡养单胞菌基因组中,共筛选到两个漆酶基因lc1和lc2,并用大肠杆菌BL21外源表达蛋白rLC1和rLC2,在体外检测其对AFB1的降解活性。同时参考前人报道,研究了氧化性辅剂对漆酶AFB1降解的促进作用。在体外实验基础上,利用自杀质粒pK18mobsacB,以同源重组方法构建了两株漆酶缺失株CW117Δlc1和CW117Δlc1-lc2,验证了漆酶基因(lc1和lc2)对AFB1体内降解作用。【结果】体外实验显示,重组酶rLC1具有AFB1降解活性,氧化性辅剂ABTS、AS或SA可显著地提高rLC1降解活性,但rLC2未显示降解活性。突变株CW117Δlc1和CW117Δlc1-lc2对AFB1仍显示了较高的降解活性,且在大多数降解时间点与野生株CW117无显著差异。【结论】微嗜酸寡养单胞菌CW117菌株中,LC1在体外显示了AFB1的降解活性,且降解活性可以被氧化性辅助因子增强,LC2未显示体外降解活性;体内试验发现,漆酶基因lc1和lc2对菌株CW117降解AFB1的贡献较小,该菌株还存在其他降解途径。     

悬浮培养发状念珠蓝细菌对盐碱胁迫的生理应答研究北大核心CSCD

天然发状念珠蓝细菌是荒漠化土壤中的"先锋生物",具有极强的耐旱、耐碱、耐高温等能力。本研究旨在揭示悬浮培养发状念珠蓝细菌的抗盐碱能力,为发状念珠蓝细菌的人工培养提供基础。25℃,80μmol/(m2·s)光照下,BG-11培养液培养发状念珠蓝细菌,利用不同浓度(0、60、120、180、240 mmol/L)混合的Na2SO4和Na2CO3胁迫发状念珠蓝细菌细胞,处理时间分别为24 h和72 h,测定其质膜透性、超氧化物歧化酶活性、丙二醛、脯氨酸、可溶性蛋白以及可溶性多糖含量,分析发状念珠蓝细菌细胞对盐碱胁迫的响应。盐碱胁迫下,随着胁迫程度的加重,发状念珠蓝细菌细胞的质膜相对透性增加,丙二醛含量上升;超氧化物歧化酶活性和脯氨酸含量先上升后下降;可溶性蛋白含量逐渐下降;可溶性多糖含量不断升高。悬浮培养的发状念珠蓝细菌细胞对盐碱胁迫产生结构和生理的应激响应,增强了发状念珠蓝细菌抗盐碱能力。     

集胞藻PCC6803高效基因表达平台的构建与评价

针对蓝细菌代谢工程改造的需求,成功构建了可以在模式蓝细菌菌株集胞藻PCC6803中高效表达外源基因的3个基因组整合表达平台,以及1个可以在多株蓝细菌中表达的广宿主穿梭表达平台。该表达平台通过选用集胞藻PCC6803中1,5-二磷酸核酮糖缩化酶/氧化酶的启动子驱动外源基因的表达,应用“SD-AUG”翻译融合的策略提高外源蛋白翻译效率,以及加入终止子序列Trbc以提高转录终止效率,实现了对外源基因的高效表达。利用lacZ作为报告基因,检测了所构建表达平台pFQ20在集胞藻中的基因表达效率,结果显示β-半乳糖苷酶的活性为109 Miller。同时,基于pFQ20表达平台在集胞藻PCC6803中表达了来自大肠杆菌的硫酯酶基因tesA’,蛋白印迹实验结果显示了硫酯酶的成功表达。该表达平台为在蓝细菌中开展遗传研究及基因工程改造提供了有用的遗传工具,其构建策略为在蓝细菌中构建高效稳定的外源基因表达元件提供了借鉴。