少孢节丛孢中CRISPR/Cas9基因编辑系统的建立及6-甲基水杨酸合酶新活性位点的发现

以捕食线虫真菌少孢节丛孢Arthrobotrys oligospora YMF 1.03170为研究材料,通过优化sgRNA 表达驱动体系 tRNA^Gly,构建CRISPR/Cas9基因编辑系统,成功获得基因定点编辑菌株。将该CRISPR/Cas9系统与同源重组相结合,可精确地对两个目的氨基酸编码基因同时进行定点置换。结合代谢图谱及前体化合物饲喂实验,发现6-甲基水杨酸合酶编码蛋白新的活性位点Arg17、Arg18、His33和His34。本研究将CRISPR/Cas9基因编辑系统应用在少孢节丛孢中,并成功建立基因编辑精细体系,为快速构建少孢节丛孢的遗传转化体系和研究该菌的基因功能提供有效方法。     

小绒泡菌生活史及其形态建成期显微结构的观察

在完成小绒泡菌Physaum pusillum生活史的同时,观察了小绒泡菌P. pusillum生活史不同阶段显微结构的形成。生活史研究结果表明：小绒泡菌P. pusillum的孢子萌发方式为裂式,黏变形体具两根鞭毛,较短一根不易观察到,原质团类型为显型原质团,子实体形态建成过程约需12-13h。显微结构观察结果表明：石灰结和孢丝结构在原质团隆起约6h后开始形成,孢子在原质团隆起约9h后开始形成,石灰结和孢丝先于孢子形成。     

猴头菌和金针菇漆酶对不同染料的降解

利用漆酶（laccase）处理染料废水是近年来研究的热点。本研究以猴头菌Hericium erinaceus和金针菇Flammulina filiformis的发酵液为试验材料,通过硫酸铵沉淀、离子交换层析和超滤等方法,对发酵液中的漆酶进行了初步的分离纯化,然后分别研究了两种初提纯漆酶及其与小分子介体组成的漆酶介体系统（laccase-mediator system,LMS）对12种常用染料的降解效果。结果表明,猴头菌的初提纯漆酶对甲基红、铬黑T、孔雀绿和活性蓝R都具有很好的降解效果,反应24h后,降解率分别为79.6%、66.8%、80.3%和64.6%,且表现出时间依赖性,而对其他染料的降解效果不明显。当反应体系中加入介体2,2′-连氮基-双-(3-乙基苯并二氢噻唑啉-6-磺酸)二铵盐[2,2′-azinobis-(3-ethylbenzothiazoline-6-sulphate),ABTS]后,可增加猴头菌漆酶对考马斯亮蓝、结晶紫和孔雀绿的降解率,分别提高到33.7%、45.6%和94.2%。金针菇初提纯漆酶对孔雀绿、活性艳橙K-7R和活性红KD-8B都具有一定的降解效果,降解率分别为37.8%、39.9%和49%,也表现出了明显的时间依赖性。当反应体系中也加入ABTS后,金针菇漆酶对活性红KM-8B的降解率明显增加,由9.7%增加到58.2%。以上研究为猴头菌和金针菇漆酶在染料废水处理领域的应用提供了科学依据。     

双孢蘑菇对高温胁迫的响应及耐热机理

本研究以双孢蘑菇Agaricus bisporus工厂化菌株A15和筛选得到的耐高温菌株A15-TH为研究对象,比较了高温胁迫对两个菌株菌丝生长的影响,并从氧化损伤修复及基础碳代谢-糖酵解途径两个角度探索双孢蘑菇对高温胁迫的响应及耐热机理。高温胁迫下,对照菌株A15的菌丝生长速度降低,菌丝分叉增加;而耐高温菌株A15-TH菌丝生长速度高于A15,菌丝形态优于对照菌株,表现出对高温具有一定的耐受性。对两个菌株高温胁迫下氧化损伤及抗氧化酶系统进行研究发现,高温胁迫30-90min导致对照菌株A15的三磷酸腺苷（ATP）含量下降54.4%-59.6%,线粒体复合物I、II、III活性升高,超氧阴离子（O₂^-）含量增加了34.9%-71.3%;此外高温胁迫降低了超氧化物歧化酶（SOD）的活性,影响了O₂^-的清除效率。耐高温菌株在受到高温胁迫后的氧化损伤及氧化修复效果与对照菌株不同,一方面体现在正常状态下维持较低的细胞能量代谢和较高的ROS合成量;另一方面抗氧化系统中sod1、sod2、cat1与对照菌株相比有不同程度的上调,SOD和过氧化氢酶（CAT）活性增强,可以更有效地清除过量的活性氧,减轻高温对菌丝的氧化损伤。尤其在高温胁迫120min时,A15的线粒体功能及抗氧化系统受到严重损伤,线粒体复合物I、II、III活性和CAT活性大幅度下降,但是A15-TH线粒体复合体I、III活性分别增加至正常状态下的1.4倍和8.9倍,CAT活性比对照菌株高128%,维持了正常的线粒体功能及对活性氧的有效清除。进一步研究发现高温胁迫下,双孢蘑菇菌丝的己糖激酶和丙酮酸激酶活性增加,糖酵解途径加快;耐高温菌株A15-TH在正常状态下和高温胁迫下,己糖激酶和丙酮酸激酶的活性均高于对照菌株A15,具有更活跃的碳代谢。     

出芽短梗霉膨大细胞分选及产糖分析

本研究运用Percoll密度梯度离心的方法对出芽短梗霉Aureobasidium pullulans的两种细胞形态进行分选,并对两种形态的细胞进行多糖产量的分析。通过对转速、分选时间、Percoll分离液浓度的优化,确定了两种细胞形态分选效果最佳的条件是Percoll分离液浓度为60%、转速为5 000r/min、离心时间为30min。经过光学显微镜和透射电子显微镜观察发现上层为酵母状细胞（YL）、下层为膨大细胞（SC）,并发现膨大细胞外有明显的薄膜包被,且产大量多糖。也为今后在相应状态下研究出芽短梗霉膨大细胞的其他代谢机理提供了可行的方法,满足后续研究的需要。     

混合接种球孢白僵菌与摩西球囊霉对烟草促生抗逆影响

利用球孢白僵菌Beauveria bassiana与摩西球囊霉菌Glomus mosseae以单独和混合接种的方式在烟草Nicotiana tabacum苗期进行接种处理,检测烟草苗期和成熟期的农艺性状和生理特性。结果表明：在育苗期,混合接种处理烟苗具有最大的叶长和最大叶宽,与对照相比提高了30.27%和42.98%,球孢白僵菌处理组生物量最大,AM真菌处理组烟草株高最高;在成熟期,混合接种处理组烟草的株高、最大叶长、最大叶宽、茎围、生物量等指标均优于单接种处理,且过氧化氢酶（CAT）、超氧化物歧化酶（SOD）、过氧化物酶（POD）等抗氧化酶活性最高,丙二醛（MDA）含量最低。球孢白僵菌和AM真菌可协同提高烟草生长和抗逆能力。     

不同地点51个长白落叶松无性系苗期生长变异和遗传稳定性分析

长白落叶松是我国东北林区非常重要的速生用材树种之一。以不同地点51个长白落叶松无性系为材料,对其2年生苗高和地径进行调查分析,探讨其苗期生长变异和遗传稳定性。结果表明:长白落叶松无性系苗高和地径在地点间、无性系间、地点×无性系间差异均达到极显著水平(P<0.01);不同地点苗高和地径的表型变异系数处于23.89%~36.82%,除四平试验点的地径重复力为0.172外,不同地点苗高和地径的重复力均处于0.573~0.891;遗传稳定性分析结果表明,无性系LO 13等28个无性系的遗传稳定性较高;相关分析结果表明苗高与地径呈极显著正相关关系;利用多性状综合评价法,以20%的入选率对无性系进行选择,不同地点均选出10个综合表现较好的无性系,其中无性系LO 10和LO 26在不同地点均被入选优良无性系,且其遗传稳定性较强,可将其初选为优良无性系。     

肺结节病合并Alternaria alternata所致皮肤链格孢病1例

患者,女,61岁,确诊肺结节病、口服糖皮质激素7月,双手背及腕部红色斑块3个月。组织病理示表皮轻度棘层增厚,真皮浅、中层中性粒细胞、淋巴、组织细胞、浆细胞、多核巨细胞混合性浸润,可见散在双轮廓厚壁酵母样结构。六铵银染色见不规则肿胀菌丝及酵母样厚壁孢子。真菌培养见棕/灰褐色菌落,镜下见棕色分隔孢子。ITS区序列分析鉴定为Alternaria alternate。口服伊曲康唑胶囊200 mg/d,联合外用硝酸舍他康唑乳膏2次/d,连续用药4个月后皮损完全消退,随访半年,未见复发。     

基于mtDNA D-loop分析高原鳅群体遗传多样性和系统发育

本研究以高原鳅属6个群体共82尾个体的线粒体DNA D-loop高变区为标记,采用分子生物信息学方法分析其遗传多样性及系统发育关系.结果表明,在570 bp的mtDNA D-loop中共检测到149个多态位点,由此界定了 39个单倍型.在6个群体中,单倍型多样度(Hd)由高到低依次为细尾高原鳅(T.stenura)(0.899)＞东方高原鳅(T.orientalis)＞似鲶高原鳅(T.siluroides)＞达里湖高原鳅(T.dalaica)/黄河高原鳅(T.pap-penheimi)＞湘西盲高原鳅(T.xiangxiensis)(0.286);核苷酸多样度(Pi)由高到低依次为似鲶高原鳅(0.042 59)＞黄河高原鳅＞细尾高原鳅＞东方高原鳅＞达里湖高原鳅＞湘西盲高原鳅(0.000 5);细尾高原鳅与湘西盲高原鳅群体间遗传距离(0.186)最大,达里湖高原鳅与东方高原鳅群体间遗传距离(0.027)最小;细尾高原鳅与达里湖高原鳅群体间遗传分化程度(0.989)最大,似鲶高原鳅与东方高原鳅群体间遗传分化程度(0.222)最小.其中仅有一个单倍型(Hap29)为达里湖高原鳅与似鲶高原鳅群体所共有,其余均为特有单倍型.进化树显示6个高原鳅群体分为三大支,其中细尾高原鳅自成一支;湘西盲高原鳅与黄河高原鳅聚成一支;其余东方高原鳅、达里湖高原鳅和似鲶高原鳅聚成一支.Network与系统发育树结果基本一致.就单倍型丰富度和核苷酸多样性而言,似鲶高原鳅遗传多样性较高,湘西盲高原鳅遗传多样性较低.就系统发育而言,群体间的分化程度支持了其分类地位;似鲶高原鳅、东方高原鳅和达里湖高原鳅的亲缘关系相对较近;不同的聚类推测高原鳅可能至少经历了 3次驯化事件.本研究结果为高原鳅鱼类生物多样性保护和评价提供遗传学理论依据.     

双依他尼酸乙醇胺对谷胱甘肽S-转硫酶mu的选择性抑制作用

谷胱甘肽S-转移酶(GST)的同工酶mu(GSTM)高表达与卵巢癌顺铂耐药有关.以GST非选择性抑制剂依他尼酸设计二价潜抑制剂双依他尼酸乙醇胺(aminoethanol di-ethacrynic acid,ADEA),测定ADEA及其与还原型谷胱甘肽(glutathione,GSH)加合物对GST同工酶亚型A1、P1、M2的半抑制浓度(IC50)、抑制类型、结合比和结合动力学.ADEA本身对GSTM2的IC50比GSTA1低300倍,比GSTP1低3 000倍;ADEA与GSH在酶催化下反应10 min所得产物,对上述3种同工酶的IC50 分别降低5、57、200倍.ADEA本身和产物对GSTM2相对于底物CDNB是反竞争性抑制剂,ADEA本身对GSTM2相对于底物GSH是混合性抑制剂,ADEA与GSH产物对GSTM2相对于底物GSH是反竞争性抑制剂.分析ADEA对GSTM2荧光静态淬灭表明ADEA及其产物是二价结合;分析荧光和酶活性随时间变化表明酶与ADEA本身结合速度比其产物CDNB慢10倍.ADEA是有效的GSTM2选择性二价潜抑制剂.