大鼠肺微血管周细胞的体外培养及鉴定

目的:探讨SD大鼠肺微血管周细胞(rat pulmonarymicrovessel pericytes,RPMPC)的分离、培养与鉴定方法。方法:采用机械剪切、Ⅰ型胶原酶消化法和微孔过滤结合超高速离心法分离大鼠肺微血管片段,用含15%胎牛血清(FBS)的高糖培养基(DMEM)进行培养,倒置显微镜观察原代RPMPC的形态及生长特性。免疫荧光法检测神经元-胶质抗原2(neuron-glial antigen 2,NG2),α-平滑肌肌动蛋白(α-smooth muscle actin,α-SMA)、结蛋白(desmin)和CD31相关抗原的表达,同时应用免疫细胞化学法检测血小板源性生长因子受体β(PDGFR-β)的表达。CCK-8测定周细胞生长曲线。通过周细胞-内皮细胞共培养成管实验检测细胞成管能力。结果:本方法培养获取的RPMPC纯度较高,并能连续传代。细胞48 h后爬出,呈长梭形、三角形等不规则形,8~10 d细胞汇合,呈栅栏或旋涡状生长,无接触性抑制,前期可见有少量内皮细胞伴随生长,单核偶见双核,核呈卵圆形,胞浆丰富。PDGFR-β、α-SMA、NG2、desmin染色阳性,CD31阴性;周细胞与内皮细胞共培养形成管腔结构。结论:通过本方法能够获得纯度较高的肺微血管周细胞,且所获细胞具有周细胞的特性及功能。     

解纤维梭菌培养条件的优化

解纤维梭菌Clostridium cellulolyticum是产纤维小体的专性厌氧菌,由于其培养困难,目前仍难以实现高效培养.文中采用响应面法对产纤维小体的解纤维梭菌C.cellulolyticum高细胞密度培养的条件进行了优化.首先用Plackett-Burman实验设计对影响因素效应进行评价,筛选出的显著影响因素分别为:酵母提取物浓度、纤维二糖浓度及培养温度.之后用最陡爬坡实验设计逼近菌体最佳生长条件的区域范围.最后通过中心组合实验设计和响应面分析方法确定显著影响因素的水平和C.cellulolyticum的最优培养条件.优化后的显著影响因素酵母提取物浓度、纤维二糖浓度和培养温度分别为3 g/L、7 g/L和34℃.在最优条件下,摇瓶培养的菌体浓度OD600值由0.303提高到了0.586,增加了93.4％.在发酵罐批次培养条件下,菌体OD600值达到了3.432,比文献报道值高出了2.8倍.研究结果为C.cellulolyticum培养及应用研究提供了基础.     

响应面法优化海洋镰刀腐皮菌产出HMG-CoA还原酶抑制剂的培养条件

【目的】采用响应面法对海洋微生物镰刀腐皮菌FG319发酵产生MFS(Metabolite of Fusarium solani FG319)培养条件进行优化。【方法】在单因素试验结果的基础上,依据Box-Behnken中心组合原则设计诱导物添加量、培养时间、培养温度的3因素3水平响应面实验,以MFS产出量为响应值优化镰刀腐皮菌FG319的培养条件。【结果】镰刀腐皮菌FG319最优培养条件为诱导物添加量0.6%、培养时间7 d、培养温度22°C,在此培养条件下,MFS最高产量达到20.11 mg/L,是优化前的4倍,与理论预测的相对误差为0.64%,实测值与响应面预测值拟合良好。镰刀腐皮菌FG319代谢产物MFS在HMG-CoA还原酶和NADPH构筑的分子评价反应体系,当MFS添加到100 mg/L时,具有类似洛伐他汀抑制HMG-CoA还原酶的最大抑制率。【结论】响应面试验设计对镰刀腐皮菌FG319培养条件的优化是有效的,其次生代谢产物MFS体外抑制HMG-CoA还原酶的效果也是明显的。     

不同年龄小鼠精原干细胞系的建立

精原干细胞（spennatogonial stem cells,SSCs）是雄性动物体内能进行终生自我更新并能将亲代基因遗传给予子代的一类细胞。不同年龄段的小鼠有不同的建系方法。6-7d幼鼠,可以用差异贴壁或直接贴壁法;5-6周成年鼠,一般采用差异贴壁法;31周老年鼠,最好种于饲养层细胞上。通过对精原干细胞系的甲基化和特异基因分析以及睾丸体内移植验证分析,成功建立了具有功能的不同年龄段的小鼠精原干细胞系。     

杂花和紫花苜蓿原生质体分离培养条件的筛选

以杂花苜蓿‘甘农1号’和紫花苜蓿‘甘农4号’、‘阿尔冈金’及‘清水’4个适宜西北内陆黄土高原地区栽培的苜蓿愈伤组织为材料,研究酶解时间、酶液组合、酶液渗透压、愈伤组织继代培养时间、预处理措施及不同培养方法等对原生质体分离和培养效果的影响,并对培养条件进行优化。结果表明:(1)适宜4个苜蓿品种愈伤组织酶解的最佳预处理措施为0.55mol/L蔗糖或CPW溶液中预质壁分离1h,最佳继代时间均为12d。(2)‘甘农1号’、‘甘农4号’和‘清水’的最佳酶液组合均为2%纤维素酶+0.5%果胶酶+0.3%崩溃酶;‘阿尔冈金’的最佳酶液组合为2%纤维素酶+0.5%果胶酶+0.3%半纤维素酶+0.3%离析酶+0.3%崩溃酶;‘甘农1号’和‘阿尔冈金’的最佳酶解时间为12h,‘甘农4号’和‘清水’分别为14h和10h。(3)适宜4个品种酶解的甘露醇浓度分别为‘甘农1号’0.75mol/L,‘甘农4号’0.65mol/L,‘阿尔冈金’0.6mol/L,‘清水’0.55~0.6mol/L。(4)经液体浅层培养和固液培养方式均可获得4个苜蓿品种的再生愈伤组织,且固液培养法较液体浅层培养法更有利于苜蓿原生质体早期的培养和再生。     

塔里木胡杨林可培养胡杨内生细菌多样性与群落结构的时空演变格局

阐明塔河,Kiyik河,Ugan河这3条河胡杨内生细菌多样性及群落结构时空演变格局。2011年5月上旬与9月下旬从Kiyik,Ugan古河道和塔河主河道的6个采样位点采集24棵树的胡杨茎秆内存液样,用4种培养基分离纯化了588株胡杨内生细菌。16S r DNA序列分析表明,588株细菌分别属于6大类群:γ-变形菌纲(50.17%),厚壁菌门(34.58%),放线菌门(10.17%),α-变形菌纲(4.24%),拟杆菌门(0.50%),β-变形菌纲(0.34%),47个属,114种。其中有211株菌的16S r DNA相似率98.0%,它们分别属于19个属的41个物种,是胡杨林本源的潜在新菌种。假单胞菌属(29.76%)和芽孢杆菌属(19.05%)为优势属。与Pseudomonas xinjiangensis相聚类的潜在新种(74株,12.585%)是本源优势菌种。辛普森多样性指数显示,Kiyik河多样性指数为0.931,塔河为0.935;Ugan河最高,为0.969。香农-威纳均匀度指数表明,Ugan河的分布最均匀,均匀度指数为0.8570;塔河次之,为0.8314;Kiyik河最低,为0.7937。时空变化对比分析表明:整体上塔里木胡杨林内生菌群落结构的原生态状态保持较好,较少地遭受到外来优势菌群的侵染。其中,Kiyik古河道的内生菌群落结构保持原生态最好,很少受外来菌群的清洗与取代;Ugan河次之,内生菌群落结构发生了一定程度的变迁;塔河主河道细菌群落结构发生了较大程度的改变,被人类活动带来的外来常见优势菌群生态冲刷的趋势明显。     

第四届全国生物化学与分子生物学教学研讨会圆满召开

<正>2014年7月25~28日,第四届全国生物化学与分子生物学教学研讨会在吉林大学召开。本次会议由中国生物化学与分子生物学会、中国生物化学与分子生物学会教学工作委员会联合主办,由吉林大学、吉林省生物化学与分子生物学会承办,208位来自全国各地综合大学、医学院校、师范院校、工农林和中医药院校的一线教师和教学管理工作者参会。     

长效人促卵泡激素CHO细胞株的构建及其体内活性

促卵泡激素(FSH)是具有促进卵泡与睾丸发育作用的一种垂体糖蛋白激素。因其体内半衰期较短,临床上需要连续10 d以上每天注射,病人使用非常不方便。本文旨在通过提高糖基化程度,研制一种长效FSH。通过一段含有两个N-糖基化位点的连接序列,将人FSHα链与β链cDNA融合,并插入pcDNA3.1(+)表达载体。表达载体转染CHO-K1细胞后,通过G418筛选得到阳性单克隆细胞,并经PCR和Western blotting证实。该重组FSH为单链蛋白,分子量约为49 kDa。经无血清培养,工程细胞株培养上清液中重组FSH的表达量可达3 mg/L。单次注射该重组FSH能够促进大鼠卵巢发育与卵泡成熟,且药效与连续8次注射Folltropin-V的相近。实验结果显示,本研究已成功获得一种长效重组FSH。     

大鼠主动脉内皮细胞的分离培养和鉴定

目的:探索大鼠主动脉原代内皮细胞体外培养方法,为体外研究提供细胞模型。方法:分离大鼠主动脉,直接贴壁于培养皿中,荧光倒置显微镜观察细胞形态,免疫组化Ⅷ因子相关抗原染色鉴定细胞。结果:约24小时组织块边缘有游离的新生细胞长出,7天即融合成片。消化传代后细胞呈短梭形或三角形,单层生长,铺路石状,Ⅷ因子表达阳性,呈指数增殖。冻存后复苏细胞活性均超过90%。结论:用贴壁法成功建立了大鼠血管内皮细胞体外培养方法,冻存细胞存活率高,为体外研究提供了稳定的模型。     

二维回转培养对MLO-Y4骨样细胞PKD2表达定位 及胞内钙信号的影响

目的：PKD2(polycystin2,多囊肾病蛋白2)能够在细胞膜上形成无选择性的阳离子通道,在肾上皮细胞中PKD2 与初级纤毛 共定位,通过改变胞内的钙信号过程参与细胞对力学刺激的响应。本实验通过二维回转培养来模拟失重效应,旨在探讨二维回转 培养对MLO-Y4 骨样细胞PKD2 表达定位,及胞内钙信号的影响。初步了解PKD2 在小鼠骨样细胞MLO-Y4 响应力学刺激过程 中起的作用。方法：采用二维回转培养骨样细胞MLO-Y4,用RT-PCR和western blotting检测PKD2的表达,用荧光共聚焦显微镜 检测细胞中PKD2 与初级纤毛的定位及细胞内钙离子含量。结果：与对照组相比,在二维回转培养后,骨样细胞MLO-Y4 的PKD2 表达在mRNA和蛋白水平都有明显的下降,PKD2、PKD1(polycystin1,多囊肾病蛋白1)和乙酰化的α-tubulin 共定位,同时二维回 转培养降低了细胞内钙离子含量。结论：在二维回转培养下,PKD2可能通过调节自身表达来改变细胞膜上PKD 通道的数目和开 放情况来影响细胞内钙离子含量,参与骨细胞对细胞外应力的感受过程,其详细机制还有待进一步实验研究。这将对探讨骨细胞 响应力学刺激的具体机制提供重要的理论依据。