人G6PD T279A和T279S两种突变子的体外构建

目的:构建葡萄糖6磷酸脱氢酶(Glucose 6-phosphate dehydrogenase,G6PD)T279A和T279S两种突变子.方法:以Genbank No X03674为参考序列设计并合成引物、以含G6PD基因的质粒(Philip JMason博士惠赠)为模板,PCR扩增获得G6PD野生型基因片段,琼脂糖凝胶电泳后回收PCR产物,连接、转化构建克隆质粒pMD18T-G6PD;酶切pMD18T-G6PD质粒、电泳后回收目的基因片段,连接、转化构建含G6PD野生型基因的重组质粒pAL-G6PD;设计并合成含有突变序列的引物,以pAL-G6PD为模板,体外扩增获得G6PD835-海口(835A→G,T279A)和835-中国-1(835 A→T,T279S)突变子.结果:酶切后经电泳鉴定表明获得与预期大小相符的pMD18T-G6PD质粒,EcoRI和Hind Ⅲ双酶切获得与预期大小相符的pAL-G6PD,测序结果与参考序列完全一致.0.8%的琼脂糖凝胶电泳鉴定,并定量pAL-G6PD单链DNA浓度约为200ng/uL.经测序鉴定并与参考序列比对结果表明获得了G6PD的T279A和T279S两种突变子.结论:成功构建了G6PD的T279A和T279S两种突变子,为下一步原核表达、生化性质以及酶动力学等研究奠定了基础.     

雷丸菌核与发酵菌丝蛋白体外抑瘤对比分析

目的:研究雷丸发酵菌丝与菌核蛋白体外对肿瘤细胞HepG2的抑制作用.方法:分别提取雷丸菌核与发酵菌丝蛋白,进行体外抑瘤试验,记录细胞形态变化,计算抑瘤率,分析两者在抑瘤效果上的差异.结果:两种提取蛋白在体外对HepG2肿瘤细胞的抑制作用相近,最高可达80%左右.结论:发酵菌丝蛋白具有显著抑瘤作用,在深入研究药理毒理的基础上可替代菌核入药.     

N-乙酰鸟氨酸脱酰基酶活性位点的构成研究

目的:用生物信息学软件预测出N-乙酰鸟氨酸脱酰基酶的活性中心的金属离子结合位点.方法:选用DEPC、WRK、PMSF、NBS、DTNB 5种化学试剂选择性修饰N-乙酰鸟氨酸脱酰基酶中组氨酸、天冬氨酸、谷氨酸、丝氨酸、色氨酸和半胱氨酸;同时考察Co2、Fe3 、Mg2 、Mn2 、ZN2 、Ni2 、Cu2 等金属离子对酶活性的影响.结果:在DEPC、WRK修饰后,酶的活力明显下降,而PMSF、NBS、DTNB对酶的活力影响不大;说明组氨酸和酸性氨基酸为酶活性中心的必需氨基酸,而丝氨酸残基、色氨酸残基、半胱氨酸残基不参与酶活性中心的组成;Co2 对酶反应有促进作用,验证了生物信息学的预测结果;底物N-乙酰-D,L-蛋氨酸对酶有较好的保护作用,保护作用随浓度增加而增加.结论:本研究为深入研究酶结构与功能的关系提供实验依据,为N-乙酰鸟氨酸脱酰基酶的工业应用提供理论参考.     

三种膀胱灌注方法对膀胱树突状细胞及尿IL-2的影响

目的:探讨联合灌注预防膀胱肿瘤复发的免疫机制.方法:将44只雌性wistat大白鼠随机分为生理盐水对照组以及BCG组、丝裂霉素组、IL-2联合BCG组,分别定期进行11次膀胱灌注并分批处死取出膀胱组织,用免疫组化的方法检测膀胱组织中DC的数量,用双抗体夹心酶免疫吸附法(ELISA)测定尿IL-2含量,观察膀胱组织DC及尿IL-2的变化.结果:DC平均数量:IL-2联合BCG组为(28.3±8.0 CDS/HPF)、BCG组为(16.6±5.9 CDS/HPF)、丝裂霉素组为(4±2.3 CDS/HPF)、对照组为(4.8±3.4CDS/HPF);尿IL-2浓度:IL-2联合BCG组为(87.5±30.4 ng/L)、BCG组为(58.7±20 ng/L)、丝裂霉素组为(35.9±9.6ng/L)、对照组为(35.7±11.3 ng/L).结论:IL-2和BCG两者间有免疫促进和协同作用.     

原代培养骨骼肌细胞胰岛素抵抗模型的建立

目的:观察高脂负荷在胰岛素抵抗形成中的意义.方法:用不同浓度椋榈酸、胰岛素分别培养骨骼肌细胞2h、6h、12h、24h,对棕榈酸诱导组的一部分细胞给予1× 10-7M胰岛素刺激2h,用血糖检测试剂盒(GOD-POD)检测各组培养液中的葡萄糖含量,研究不同浓度棕榈酸、胰岛素对骨骼肌细胞摄取葡萄糖的影响,观察胰岛素的生理功效的变化.结果:0.6mM棕榈酸诱导12h以上或者5×101-M胰岛素诱导24h后,培养液中的葡萄糖浓度比正常组高且有显著性差异,表明细胞的糖代谢能力降低.经1×10-7M胰岛素刺激2h后的棕榈酸诱导组,培养液中葡萄糖的浓度与未经胰岛素刺激的棕榈酸诱导组相比无显著差异,胰岛素的生理功效降低,证实棕榈酸诱导组细胞已对胰岛素产生耐受.结论:高脂或高胰岛素条件均可诱导原代骨骼肌细胞胰岛素抵抗模型.     

α-淀粉酶水解魔芋飞粉最佳条件优化的研究

本研究采用单因素和正交试验的方法对α-淀粉酶水解魔芋飞粉的酶用量、pH值、温度、[Ca2 ]和底物浓度等条件进行优化,结果表明当α-淀粉酶用量为4u/g淀粉、pH为6.0、温度为60℃、[Ca2 ]为0.01mol/L和底物浓度为8%时,水解度达20%,为最佳反应条件,研究为进一步利用α-淀粉酶水解魔芋飞粉生产燃料乙醇奠定了基础.     

雷帕霉素治疗系膜增殖性肾小球肾炎的临床研究

目的:观察低剂量雷帕霉素(RPM)治疗增殖性肾小球肾炎的临床疗效和病理改变,并对其安全性进行评价.方法:纳入标准:临床诊断为肾小球肾炎,肾活检证实为中到重度系膜增生(伴有或不伴有Iga沉积);尿蛋白小于800mg.d-1;肾功能正常.排除标准:尿蛋白大于800mg.d-1;急性肾小管坏死存在;患高脂血症,合并其他器质性疾病.观察时间:6个月,停药后继续随访6个月.试验终点:尿蛋白大于3.5 g.d-1;顽固高脂血症药物无法控制;血清肌酐迅速增高;其他严重副反应.给药方法:低剂量RPM(宜欣可口服溶液)口服,3d诱导后根据目标全血谷浓度3-5ng.ml-1调整用药剂量.按计划记录临床和实验室情况.根据临床表现、蛋白尿和/或血尿情况判断疗效,以缓解、改善和无效计,在第6月结束时进行重复肾活检,观察肾组织病理变化并进行肾小球评分,判断病理疗效.结果:共入选11例中到重度系膜增生性肾炎患者,BPM全血谷浓度目标值在3-5 ng.ml-1时药物剂量平均为1.5±0.6mg.d-1;4例达到临床缓解(36.4%),4例改善(36.4%),3例无效(27.3%),总有效率72.7%.与治疗前比较,治疗有效的8例病理结果显示,肾小球内细胞数明显下降,基质增生减轻,毛细血管襻管腔面积增加,肾小球评分具显著性差异(p＜0.05);不良反应包括1例恶心、纳差,1例白细胞下降,以及1例轻度转氨酶升高、2例轻度血脂升高,均在允许靶浓度范围内调整用药后控制,无需针对性治疗和停药,未影响试验.结论:低剂量RPM口服治疗中到重度系膜增生性肾炎疗效可靠,副反应轻,安全性较好.但仍需多中心、大规模的临床试验证实.     

金天格胶囊对成骨细胞作用的研究

目的:观察金天格胶囊对成骨细胞的直接刺激作用.方法:采用酶消化法分离培养成骨细胞,加入不同浓度的金天格胶囊药液,测定碱性磷酸酶(AKP)、骨钙素(BGP)和尿液吡啶酚(PYD)的含量.结果:AKP、BGP水平随药物浓度增加而升高.PYD反而减少(P<0.05).结论:金天格胶囊对成骨细胞有直接刺激作用;对破骨细胞也有抑制作用.     

实用性同位体标记技术

同位体标记技术．诸如iTRAQ（相对和绝对定量的同位体标签）．可以通过报道子离子信号对多元肽进行定量。因为用RAQ允许对多达8个不同的标签集进行分析．所以比只容纳2—3个标记物的代谢标记技术（重同位素标记）更为优越。虽然如此．直至最近在用离子阱质谱仪进行的串联质谱分析中低质量片段的回收率都很差．所以在许多分析平台中很难应用ITRAQ．     

植物是如何转运和调控的？

李乐攻教授长期从事植物离子或小分子的转运、调控研究,在此领域取得了令国际瞩目的成果,为了了解植物离子或小分子的转运、调控研究的国际国内进展,记者深入到李乐攻教授的实验室对李乐攻教授进行了采访。《生物技术世界》记者：请问植物离子或小分子的转运和调控研究有什么意义？