牛-牛及山羊-牛克隆胚胎体外培养条件的优化

通过胞质内注射法将牛和山羊胎儿耳朵成纤维细胞分别注入去核牛卵母细胞中构建同种胚胎和异种胚胎。采用mCR2aa和mSOF分别培养,然后在mSOF中按不同培养时间添加8mg/mLBSA或者10?S,培养前3d和培养3d后添加的补充物质及次序为:(1)BSA FBS;(2)BSA BSA;(3)FBS BSA;(4)FBS FBS。根据培养胚胎的卵裂率、8/16-cell发育率、囊胚发育率及囊胚细胞数筛选出最好的培养方法。结果:(1)mSOF中培养同种胚胎和异种胚胎的卵裂率,8/16-cell发育率以及囊胚发育率均明显高于在mCR2aa中的培养结果(P<0.05)。(2)添加BSA FBS组的mSOF培养胚胎的卵裂率、8/16-cell发育率、囊胚发育率和囊胚细胞数同种依次为79.8%±7.1%、49.7%±3.5%、21.5%±1.8%和115.2±4.3,异种依次为40.1%±6.3%、29.2%±2.0%、13.4%±2.1%和100.1±3.0,均明显高于其他培养组(P<0.05)。结论:山羊-牛异种克隆胚胎可以用优化的牛胚胎培养体系进行培养。同种胚胎和异种胚胎的最佳培养方法均为前3d用mSOF BSA培养液,3d后用mSOF FBS培养液。     

中国紫金牛属圆齿组果实微形态特征研究

对国产紫金牛科紫金牛属圆齿组(Ardisia Sect. Crispardisia)16种植物的果实表面进行了扫描电镜观察。经观察果实为球形,表面多无毛,稀有柔毛。多数种具腺点,极少数无腺点或不明显,腺点疣状、粒状或横棒状,腺点常与果实表面突起具对应关系。果实表面纹饰大致可分为3种:基本平滑、多皱、波状网纹。某些种不同部位的纹饰差异较为明显。本研究结果对种间鉴别具有重要意义,并且不支持将珍珠伞A. maculosa归并入钮子果A. polysticta中。     

牛血清白蛋白单克隆抗体杂交瘤细胞株的建立及鉴定

用牛血清白蛋白(BSA)免疫BALB/c小鼠,取其脾细胞与小鼠骨髓瘤细胞SP2/0进行融合,培养上清经过双抗体夹心法检测初步筛选分泌鼠IgG的杂交瘤细胞,将此种杂交瘤细胞注射小鼠产生的腹水用间接ELISA法筛选,获得4株能稳定分泌抗BSA单克隆抗体的杂交瘤细胞株,分别命名为2A5、3A3、3G6、4A8。鉴定结果显示,2A5细胞分泌IgG2a/κ,其余3株细胞分泌IgG1/κ;纯化后4株腹水单抗的纯度达90%以上,对BSA的ELISA滴度均可达到1∶100000以上;4株单抗均不与人以及马、猪、羊、兔、豚鼠等血清发生交叉反应;W estern B lotting试验证明4株单抗均识别分子量为68000的BSA;用间接ELISA法测定4株单抗相对亲和力及相对敏感度大小依次为3A3>2A5>3G6>4A8;杂交瘤细胞株连续培养3个月以及冻存半年后复苏,细胞生长良好,杂交瘤细胞分泌的抗体效价稳定。     

Akkermansia与高原牛肺水肿病相关性研究

【目的】本文通过对高原牛胃肠道菌群结构组成的分析,从微生物学角度探讨Akkermansia与高原牛肺水肿病的关系。【方法】本研究以沈阳地区健康娟姗牛为对照,以引进入拉萨半年的健康娟姗牛、拉萨本地健康黄牛以及引进入拉萨半年患肺水肿病的娟姗牛的粪便作为分析样本,采用Illumina MiSeq高通量测序技术测定样本中微生物16S rRNA基因V3–V4区序列,通过比较4种粪便样本菌群组成及丰度的差异,探讨Akkermansia与高原牛肺水肿病的相关性。【结果】Verrucomicrobia中Akkermansia在拉萨本地健康黄牛的胃肠道中的含量显著高于引进入拉萨半年的健康娟姗牛,在引进入拉萨半年患肺水肿病的娟姗牛胃肠道中的含量显著高于引进入拉萨半年的健康娟姗牛。在属水平上,沈阳地区健康娟姗牛胃肠道菌群中Akkermansia丰度占比为0.07%;引进入拉萨半年的健康娟姗牛胃肠道菌群中Akkermansia丰度占比为0.09%;拉萨本地黄牛胃肠道菌群中Akkermansia丰度占比为6.62%,是优势菌属;引进入拉萨半年的患肺水肿病的娟姗牛胃肠道菌群中Akkermansia丰度占比为11.85%,且是第一优势菌属。【结论】首次从微生物学角度探讨Akkermansia与高原牛肺水肿病的关系,为将Akkermansia丰度作为诊断肺水肿病的监测指标提供参考,但具体丰度值还有待进一步研究。     

敲减MC4R表达对牛胎儿成纤维细胞CMS系统关键因子的影响

为获得敲减黑素皮质素4受体（melanocortin 4 receptor,MC4R）基因的牛胎儿成纤维细胞,并探讨其在能量平衡神经调节系统中的作用,将构建成功并已鉴定为有效序列的短发夹状RNA (short hairpin RNA, shRNA)真核表达载体pGSH1 GFP MC4R,利用阳离子脂质体转染牛胎儿成纤维细胞并使用G418筛选稳定转染细胞株.利用实时荧光定量和Western印迹检测MC4R及中枢黑素皮质素系统(central melanocortin system, CMS)关键因子的表达水平变化.结果表明,在稳定转染的牛胎儿成纤维细胞系中, MC4R表达显著抑制,瘦蛋白(leptin)和阿黑色素原(POMC)表达下调,黑素皮质素拮抗物agouti相关蛋白(AGRP)和MC3R表达上调,而神经肽Y (NPY)表达无明显改变.综上所述,本研究成功获得了敲减MC4R基因表达的牛胎儿成纤维细胞.相关基因表达水平检测结果提示, MC4R的表达水平对CMS系统中的各关键基因的表达有不同的抑制或促进影响.     

牛卵丘细胞的生长特征与转基因

目的了解牛卵丘细胞的生长特征及构建的基因载体对卵丘细胞的转染情况和转染后阳性细胞的扩增效率。方法用透明质酸酶消化牛卵丘/卵母细胞复合体(COCs)获得牛卵丘细胞,了解牛卵丘细胞的生长特点,并用分子大小分别为7178 bp和31 085 bp两种带有增强绿色荧光蛋白(EGFP)和新霉素抗性基因(Neor)的质粒载体pMSCV-EGFP-Neor和pGC1-collagen-EGFP-Neor分别转染靶细胞。结果用脂质体法转染对数生长期的细胞,均获得了绿色荧光阳性细胞,但小质粒的转染效率在72 h时是大质粒的6倍(14%vs.2.3%)。在800μg/mLG418筛选浓度下,14 d后分别获得了7个和3个较明显的单克隆细胞群,对它们进行挑选、扩大,都获得了较纯的单克隆细胞系。最后根据EGFP和collagen的已知基因序列对转染pGC1-collagen-EGFP-Neor质粒的阳性细胞进行三个不同区域DNA片段的扩增,结果表明,扩增的基因片段大小正确,数目完整。结论对卵丘细胞进行基因转染,分子大小等于或小于31 kb的基因可以有效转入,但小分子载体比大分子载体具有更高的转染效率。经过筛选都可以获得纯的转基因细胞...     

牛磺胆酸钠在大鼠急性胰腺炎模型中的半数致死量（LD50）研究

目的：通过使用不同浓度的牛磺胆酸钠（Tc）建立急性胰腺炎（AP）模型,观察相应的死亡率,进而计算其半数致死量。方法：使用不同浓度的TC（0％（wt／v1）、1％、2％、3％、4％、5％、9％）观察AP造模72小时后各组的死亡率。同时分析TC浓度与组织病理评分、血清淀粉酶和外周血细胞变化的相美性。结果：TC的卓数致死量为3．409％。并且,TC的浓度与组织病理评分、血清淀粉酶和外周血细胞变化密切相关。结论：TC所致AP造模的最佳剂量为3．409％。     

牛肠激酶催化亚基工程菌的构建

目的：构建牛肠激酶催化亚基工程菌。方法：将带有牛肠激酶催化亚基（bEKL）的结构基因进行克隆,将克隆产物纯化后,构建bEKL克隆质粒,后构建bEKL表达质粒,并将表达质粒制导入备感受态细胞,进行蛋白表达。结果：琼脂糖电泳验证牛肠激酶催化亚基基因已经成功地插入表达载体,序列与预期设计一致。结论：表达质粒构建成功。     

牛肠激酶催化亚基工程菌的构建

目的:构建牛肠激酶催化亚基工程菌。方法:将带有牛肠激酶催化亚基(bEKL)的结构基因进行克隆,将克隆产物纯化后,构建bEKL克隆质粒,后构建bEKL表达质粒,并将表达质粒制导入备感受态细胞,进行蛋白表达。结果:琼脂糖电泳验证牛肠激酶催化亚基基因已经成功地插入表达载体,序列与预期设计一致。结论:表达质粒构建成功。     

小鼠-牛体细胞种间核移植

本文探讨了小鼠-牛异质胚构建的简便方法及小鼠体细胞核在牛卵母细胞中重新编程的可能性。以牛的卵母细胞为细胞质供体,用去除透明带及徒手切割的方法去核,设定电压1.5 KV/cm,脉冲时间40μsec,与小鼠皮肤成纤维细胞进行电融合的融合率为67.44%,卵裂率为30.23%。融合细胞经离子酶素-6-DMAP激活,用微滴内压制做窝的方法培养小鼠皮肤成纤维细胞异质胚,异质胚的最终发育阶段为8细胞期。结果表明,去透明带牛卵母细胞经切割法去核,可用于小鼠异质胚构建;微滴内做窝的体外培养方法可避免无透明带胚胎的聚合。