定点突变提高解淀粉芽孢杆菌JP-21脲酶应用特性

氨基甲酸乙酯(Ethylcarbamate,EC)是一种存在于发酵食品和酒精饮料中的可致癌物,过量摄入可能会影响人体健康。酶法降解是减少发酵食品中氨基甲酸乙酯及其前体尿素含量的有效方法之一。脲酶具有氨基甲酸乙酯水解酶和尿素酶两种活性,因此在减少发酵食品中氨基甲酸乙酯及其前体尿素方面具有良好的应用前景。目前脲酶降解发酵酒精饮料中氨基甲酸乙酯面临的主要问题是脲酶对氨基甲酸乙酯的催化活性及亲和力较低,因而其降解效果不理想。文中成功在大肠杆菌Escherichia coli中表达了来源于解淀粉芽孢杆菌Bacillus amyloliquefaciens JP-21的脲酶,表达水平为尿素酶3 291.74 U/L,氨基甲酸乙酯水解酶227.26 U/L。通过模拟脲酶中催化亚基UreC与氨基甲酸乙酯对接的结构,确定了M326和M374这两个影响酶与底物结合的位点。采用点饱和突变获得了3株氨基甲酸乙酯水解酶活性提高的突变体M374A、M374T和M326V,以EC为底物时的Km分别为101.84mmol/L、129.49 mmol/L和121.67 mmol/L,比野生型分别降低了37.47%–50.82%。突变体可以降解黄酒中97%的尿素,M374T对黄酒中EC的降解效果最好,可将黄酒中EC从513.90μg/L降至393.57μg/L,降解率是野生脲酶的1.97倍。研究结果对今后改造脲酶催化特性和改善其应用特性具有重要意义,可为开发减控发酵食品中的微生物代谢氨(胺)类危害物策略提供参考。     

典型草原大针茅种群空间格局及对长期过度放牧的响应

种群空间格局是生态学研究的基本问题之一。典型草原带由于过度放牧退化严重, 原生群落罕见, 探讨原生群落的种群空间格局具有重要生态学意义。大针茅(Stipa grandis)草原是典型草原区广泛分布的主要群落类型, 1979年围封的大针茅样地, 是目前保存完整的大针茅草原原生群落。本文选择大针茅草原原生群落和长期过度放牧群落, 应用O-Ring函数结合不同零假设模型分析了大针茅种群的空间格局。结果表明: 在原生群落中大针茅种群在小尺度范围内呈均匀分布, 而在长期过度放牧群落中则表现为聚集分布。这说明在大针茅草原原生群落中竞争是主要的相互作用, 而在长期过度放牧群落中正相互作用居主导, 验证了胁迫梯度假说; 同时证明长期过度放牧改变了种群空间格局。     

生境梯度影响下的天然红松种群空间格局与种内关联

为理清生境梯度下天然红松种群空间分布规律,以黑龙江省凉水国家级自然保护区内自坡底至坡顶的四种生境(生境Ⅰ,谷地平坡潮湿生境;生境Ⅱ,坡下缓坡潮湿生境;生境Ⅲ,坡上斜坡半湿润生境;生境Ⅳ,坡顶陡坡半干旱生境)类型中建群种红松种群为研究对象。分析不同林层(主林层、亚林层、演替层、更新层)红松种群的数量特征,并基于O-ring函数,在重复采样条件下评价了红松种群空间分布格局。结果表明:(1)下坡位生境(生境Ⅰ、Ⅱ)红松更新层种群数量显著大于上坡位(生境Ⅲ、Ⅳ)(P0.05),演替层中差异不显著;自坡底至坡顶的生境梯度上,主林层和亚林层中红松株数比例增加,红松种群年龄结构结构由倒J型向J型转变。(2)下坡位原始红松林更新层和演替层中红松种群聚集规模与聚集强度均高于上坡位,坡顶(生境Ⅳ)原始红松林更新层中红松种群聚集规模与聚集强度高于坡上(生境Ⅲ)。(3)四类生境的原始红松林中主林层与更新层中红松种群总体表现为空间独立,在个别尺度上表现出微弱的空间正关联或负关联;在0—5 m尺度上,下坡位红松林原始林内演替层与主林层红松种群表现为空间负关联,而上坡位生境林分对应林层间空间关系则为空间正关联;四类生境中,亚林层与主林层中红松种群在全部研究尺度上均表现为空间独立。可以认为,造成上坡位生境的原始红松林中幼树、幼苗聚集规模与强度弱于下坡位的原因是上坡位更新与演替层中种群数量较少;而随坡位上升,更现层、演替层与主林层中红松种群间的空间关系由空间负关联向空间正关联转变是生物与非生物因子共同作用的结果。研究结果为阔叶红松林的经营管理与生态修复提供了理论依据。     

2种调查方法对四川黑竹沟国家级自然保护区3种雉类种群密度调查的比较

种群数量是物种的重要生态学基础资料,合适的密度调查方法是数量估算的基础。2016年4-5月,采用广泛应用于鸡形目Galliformes鸟类种群密度调查的样线法和样点法,调查了四川黑竹沟国家级自然保护区3种鸡形目鸟类(白腹锦鸡Chrysolophus amherstiae、红腹角雉Tragopan temminckii和血雉Ithaginis cruentus)的种群密度。样线法和样点法估算的雄体密度分别是:白腹锦鸡1.20只/km^2和(6.31±0.98)只/km^2,红腹角雉5.41只/km^2和(0.39±0.17)只/km^2,血雉3.01只/km^2和(5.97±2.70)只/km^2。除红腹角雉外,样点法估算的白腹锦鸡、血雉种群密度均大于样线法。建议针对不同鸡形目鸟类采用不同的调查方法,并尽量扩大样本数量,从而提高调查结果的准确性。     

吉林珲春地区利用花绒寄甲防治光肩星天牛的可行性研究

【目的】探究光肩星天牛Anoplophora glabripennis(ALB)在吉林珲春的耐寒性,为实现在当地释放花绒寄甲Dastarcus helophoroides防治ALB提供理论基础。【方法】于吉林珲春采集被ALB危害的杨树木段,室内解剖木段后收集各虫态/龄期ALB,并测量这些天牛的过冷却点。通过设置同一时间(0.5 h)下0、4和8℃不同驯化温度和最适驯化温度下0.5、1和4 h不同驯化时间,以明确花绒寄甲成虫的过冷却能力受驯化温度和驯化时间的影响。将上述两组数据进行综合,分析ALB大幼虫与不同冷驯化条件下花绒寄甲成虫过冷却点的相关性。【结果】ALB卵(分布在树皮表层)的过冷却点最低,随着其不断发育并向树内蛀食,其过冷却点逐渐升高,即不同虫态/龄期的过冷却点大小顺序为卵?小幼虫(100mg以下)?大幼虫(500 mg以上)。花绒寄甲成虫的过冷却能力受低温驯化影响明显,4℃条件下冷驯化0.5 h时最易提高其耐寒性。ALB大幼虫的过冷却点显著高于0(0.5 h)、4(0.5 h)、8(0.5 h)和4℃(1 h)冷驯化条件下处理的花绒寄甲成虫。【结论】ALB能以高于当地最低温的过冷却点越冬,除受自身耐寒能力影响外,还与所处微生境有关。而花绒寄甲成虫在经历一定时间的快速冷驯化处理后,过冷却点显著降低,耐寒性得到明显提高。表明吉林珲春等高纬度地区利用花绒寄甲防治ALB存在较大的可行性。     

云斑白条天牛雌雄成虫四个线粒体基因的序列比较

[目的]比较云斑白条天牛Batocera lineolata成虫雌雄个体的4个线粒体基因的序列差异,为研究种群个体分化和系统发育提供借鉴.[方法]以危害杨树云斑白条天牛种群为研究对象,分别提取并扩增云斑白条天牛雌雄成虫的线粒体DNA的COⅠ、COⅡ、Cytb、16S rRNA4个基因.通过序列比对,分析比较4个线粒体基因序列在雌雄成虫个体间的差异.[结果]危害杨树云斑白条天牛雌雄成虫的4个线粒体基因存在差异.在碱基序列相似度方面,COⅡ基因雌雄成虫间差异最大,相似度为98.3％,在比较的650个碱基位点中,2个缺失碱基,8个不一致碱基;其次为COⅠ,相似度为98.6％,比较的714个碱基位点中,5个缺失碱基,2个不一致碱基;再次为Cytb,相似度为98.9％,在比较的472个碱基位点中,4个不一致碱基;差异最小的为16S rRNA,相似度为99.2％,在比较的833个碱基位点中,2个缺失碱基,3个不一致碱基.在碱基含量方面,4个基因雌成虫A+T与C+G含量差值均高于雄成虫,Cyt b基因雌雄成虫A+T高出C+G含量的差值最高分别为40.84％和40.96％,16S rRNA差值其次分别为40.10％和40.70％,COⅡ差值再次分别为38.94％和38.22％,COⅠ差值最小分别为30.52％和30.16％.[结论]危害杨树云斑白条天牛雌雄成虫的mtDNA COⅠ、COⅡ、Cytb、16S rRNA在碱基序列相似度和碱基含量方面均存在差异,在分析种群个体分化和系统发育时,条件允许的情况下可以区分云斑白条天牛雌雄个体.     

体重和时间节律对俄罗斯鲟(Acipenser gueldenstaedti Brandt)幼鱼耗氧率和窒息点的影响

采用流水法研究了在温度(20.7±0.55)℃下体重和时间节律对俄罗斯鲟(Acipenser gueldenstaedti Brandt)幼鱼耗氧率和窒息点的影响。结果表明,俄罗斯鲟的耗氧率、窒息点与体重负相关,耗氧量与体重正相关。俄罗斯鲟体重(1.39±0.24)g时平均耗氧率为(0.51±0.06)mg/h.g,平均耗氧量为(0.68±0.03)mg/h.ind;体重(3.16±0.22)g时,平均耗氧率为(0.35±0.04)mg/h.g,平均耗氧量为(0.97±0.10)mg/h.ind;体重(6.20±0.36)g时平均耗氧率为(0.28±0.04)mg/h.g,平均耗氧量为(1.46±0.33)mg/h.ind。3种规格俄罗斯鲟的窒息点分别为2.38、2.35和1.98 mg/L。     

二点委夜蛾非典型嗅觉受体AlepOrco的基因克隆、原核表达及多克隆抗体制备

【目的】非典型嗅觉受体(olfactory receptor co-receptor, Orco)与典型嗅觉受体共同形成离子通道,在昆虫嗅觉识别中具有至关重要的作用。本研究旨在克隆和表达二点委夜蛾Athetis lepigone Orco基因,明确其分子特性,为进一步研究该基因在二点委夜蛾中的功能奠定基础。【方法】将二点委夜蛾雌雄成虫触角转录组数据建立本地数据库,通过生物信息学分析获得二点委夜蛾Orco同源基因AlepOrco;利用RT-PCR方法克隆二点委夜蛾AlepOrco基因全长,并在pGEX-6P-1/BL21(DE3)系统中进行了该基因开放阅读框(ORF)的原核表达,制备多克隆抗体,用Western blot检测抗体特异性;利用qPCR技术检测该基因在二点委夜蛾雌雄成虫不同组织(喙、触角、去除触角和喙的头、胸、腹、足和翅)中的表达谱。【结果】获得了二点委夜蛾AlepOrco的cDNA(GenBank登录号:MN583125)全长序列,开放阅读框长1 422 bp,编码473个氨基酸,序列中有7个跨膜结构区,预测等电点为8.59,分子量为53.40 kD。SDS-PAGE和Western blot分析结果表明AlepOrco能够在大肠杆菌Escherichia coli中高效表达。利用制备的多克隆抗体对二点委夜蛾AlepOrco进行Western blot检测,其能够特异识别成虫触角中AlepOrco蛋白。qPCR结果表明,AlepOrco在二点委夜蛾雌雄成虫不同组织间具有相似的表达模式,都是在触角中的相对表达量最大,在翅中的表达量最小。【结论】克隆并原核表达了二点委夜蛾非典型嗅觉受体基因AlepOrco,制备的多克隆抗体能够特异识别二点委夜蛾成虫触角中的AlepOrco。结果为深入了解二点委夜蛾AlepOrco基因的结构和功能奠定了基础。     

四点白钩蛾属及中国一新纪录种(鳞翅目,钩蛾科,钩蛾亚科)

首次记录四点白钩蛾属Dipriodonta Warren,1897在中国大陆分布,并记述中国1新纪录种,四点白钩蛾Dipriodonta sericea Warren,1897.提供了属种描述和鉴别特征,给出了种检索表及成虫和外生殖器图.     

研究报告：Ⅳ型胶原在癌侵袭转移过程中的动态变化：脉冲模式

结合量子点原位分子成像技术探究了基于Ⅳ型胶原动态改变的癌侵袭转移模式．收集肝癌、胃癌、乳腺癌和宫颈癌的临床病理标本,利用免疫组化和量子点成像技术对癌细胞及其相关微环境中的关键分子进行成像,观察癌侵袭转移过程中Ⅳ型胶原的动态变化．结果表明,在癌侵袭和转移过程中Ⅳ型胶原呈现动态改变．首先在基底膜处交联增多,形成不规则且致密的袖套包裹癌巢;随后多处基底膜处的胶原发生构象改变并被降解形成侵袭前锋．同时,伴随着间质中的Ⅳ型胶原重新线性沉积及巨噬细胞的团聚增多,癌细胞最终逃逸转移．由上述结果可以断定,癌侵袭转移呈现“脉冲模式”,Ⅳ型胶原的动态改变为癌侵袭转移创造了适宜的微环境．