布氏锥虫苯丙氨酰-tRNA合成酶在大肠杆菌中的克隆、表达、纯化及活性测定

苯丙氨酰-tRNA合成酶是布氏锥虫蛋白合成过程中的一类重要酶,以其为靶点的抑制剂可能发展成为新一代的抗锥虫药物,但此前并没有分离锥虫苯丙氨酸-tRNA合成酶的报道。本研究用大肠杆菌成功克隆表达并纯化了布氏锥虫苯丙氨酰-tRNA合成酶并进行了活性测定。首先通过PCR方法从布氏锥虫细胞基因组中分别扩增出苯丙氨酰-tRNA合成酶的α亚基、β亚基的基因,依次克隆入pCOLADuet共表达载体,然后在大肠杆菌BL21(DE3)RIPL中进行了成功表达,并采用Ni-Bind亲和层析对其进行了纯化,最后用免疫印迹进行了鉴定。此外还采用放射性同位素方法进行了酶活性测定,这为下一步进行布氏锥虫苯丙氨酰-tRNA合成酶抑制物的设计和体外筛选奠定了良好的基础。     

木薯高、低粉品种贮藏根生长关键期的生理生化特性比较

通过研究木薯Manihot esculenta高粉和低粉品种贮藏根在发育关键期(形成–膨大期)主要生理生化性质的差异及其动态变化，为木薯栽培管理和育种改良提供理论基础。对高粉木薯品种‘辐选01’(FX01)和‘Kasetsart 50’(KU50)以及低粉品种‘华南124’(SC124)和‘9I’于种植后120、130、140、151和165 d五个时期分别取贮藏根样品，测定淀粉、可溶性糖、脱落酸(ABA)、保护酶、活性氧(ROS)、丙二醛(MDA)等生理生化指标并分析变化规律。结果表明，可溶性糖含量在贮藏根皮层中始终高于淀粉储藏区；高粉品种中总可溶性糖含量在贮藏根膨大期快速增加，且表现出较高的抗氧化酶活性和较低的ROS及MDA含量；ABA含量呈现出高粉品种比低粉品种低的趋势。木薯低粉和高粉品种中可溶性糖的分布与其转运后合成淀粉的规律相一致，高粉品种中淀粉的积累速率始终高于低粉品种，其较高的抗氧化酶活性和较低的ROS及MDA含量有利于木薯贮藏根中淀粉的积累。     

含不同Anti-Waxy基因拷贝数的稻米直链淀粉含量分析

将含单拷贝Anti-Waxy基因的纯合植株分别作为父本或母本进行正反交,获得两组含双拷贝Anti-Waxy基因的杂交后代,分析了未转基因对照、转基因亲本及两组杂交后代糙米直链淀粉含量以揭示不同Anti-Waxy基因拷贝数对降低稻米直链淀粉含量程度的影响.结果显示,2个单拷贝转基因水稻糙米直链淀粉平均含量分别为10.72%和11.13%,比对照分别降低17.98%和14.84%;两组正交和反交杂交后代糙米直链淀粉平均含量分别为8.96%和8.23%,其平均值为8.60%,比2个转基因杂交亲本糙米直链淀粉含量分别降低19.78%和22.73%,比对照降低了34.20%.结果表明,增加转基因水稻基因组中Anti-Waxy基因拷贝数在一定程度上能够进一步降低稻米直链淀粉含量,通过将独立转化获得同品种转基因植株之间杂交可以成为获得高表达转基因植物的途径.     

毛葡萄芪合成酶基因的克隆及序列分析

芪合成酶是白藜芦醇生物合成过程中起关键作用的酶.通过RT-PCR,从高抗葡萄黑痘病的中国野葡萄毛葡萄商-24克隆了芪合成酶基因家族的2个成员VqSTS1和VqSTS2,其cDNA全长均为1 179 bp,编码392个氨基酸.氨基酸序列分析表明,VqSTS1和VqSTS2编码氨基酸247-257位点的IPN（S/F）AGAIAGN ＂是芪合成酶家族固有的氨基酸保守结构域,368-378位点的GVLFGFGPGLT＂是芪合成酶与查尔酮合成酶家族固有的保守序列特征.在编码的392个氨基酸中,VqSTS1和VqSTS2仅有12个氨基酸不同,氨基酸一致性达97%.多重比较分析显示,VqSTS1与VqSTS2与五针松、河岸葡萄、白粉藤、华东葡萄及欧洲葡萄等STS在氨基酸水平的一致性分别为65%、96%、97%和98%.将VqSTS1和VqSTS2登录GenBank,登录号分别为EF158856和EF158857.     

防风体细胞胚发生发育中的淀粉体和多糖动态

以防风体细胞胚的发生体系为材料,通过半薄切片技术研究了培养物中淀粉体的组织化学定位,并采用分光光度法测定了不同培养阶段的多糖含量.结果发现在胚性细胞内积累了大量的淀粉体;含4%蔗糖的培养基中的胚性愈伤组织阶段多糖含量最高.研究表明糖类物质的活跃代谢为胚性细胞的分化和发育直接提供了物质和能源;大量淀粉体的存在可作为胚性细胞分化的标记.     

医用淀粉微球降解行为研究及应用

介绍了医用淀粉微球的性质,综述了医用淀粉微的球降解行为研究,介绍了医用淀粉微球降解过程研究、相应数学模型的研究及其在医药领域的应用。     

角鲨烯合成酶特异性mU6-siRNA真核表达载体的构建及鉴定

利用RNA干扰技术靶向构建角鲨烯合成酶基因ERG9特异性真核表达载体。将针对粟酒裂殖酵母(Schizosaccharomyces pombe Linder)ERG9不同部位所设计的3对siRNA序列通过重组技术克隆到质粒mU6 pro中构建真核表达重组体mU6 ERG9 siRNA1、2、3,转化DH5α菌株扩增,提取质粒通过限制性酶切和测序分析对重组表达载体进行鉴定,分析结果表明3个表达载体的设计基因插入正确,成功构建了ERG9特异性真核表达载体mU6 ERG9 siRNA,重组体的成功构建为在裂殖酵母细胞中靶向RNA干扰角鲨烯的合成从而提高辅酶Q10合成途径的代谢通量打下基础。     

磷脂酰丝氨酸合成酶基因pss的克隆与表达

磷脂酰丝氨酸合成酶能催化转酯反应,是定向合成特定磷脂类物质特别是磷脂酰丝氨酸的工具酶,但出发菌株产量低,很大程度上限制了酶法合成磷脂酰丝氨酸的工业化应用。利用表达载体pET-22b,实现了大肠杆菌磷脂酰丝氨酸合成酶基因在大肠杆菌BL21(DE3)中的同源高效表达。利用镍亲和柱对表达产物进行纯化,并用HPLC法对纯化后的重组酶的活力进行检测。结果表明,目的蛋白可在短时间内进行大量表达,蛋白含量是出发菌株的100倍,同时经6h的转酯反应转化率达到33%,重组磷脂酰丝氨酸合成酶活力达到69U/mg蛋白。     

鸭梨α-法尼烯合成酶基因双链RNAi表达载体的构建

目的：为了在转基因鸭梨植株中有效抑制转录后α-法尼烯合成酶基因（PFS）的表达,研究了α-法尼烯合成酶基因双链RNAi载体的构建。方法：利用RT—PCR技术,从鸭梨的果皮中获得了来源于PFS编码区的2个基因片段,反向连接,构建成RNAi载体。结果：经PCR扩增、限制性内切酶消化和序列测定验证,所构建的载体其序列与设计相一致。结论：克隆质粒pMD-L-S构建成功,为借助农杆菌介导法将PFS基因转化到鸭梨再生植株中奠定了基础。