黑曲霉pepD基因阻断突变菌株的构建及功能分析

运用同源重组技术破坏了黑曲霉基因组中的pepD基因,该基因编码一种类subtilisin的胞外蛋白酶PEPD。实验以黑曲霉GICC2773基因组DNA为模板,PCR扩增pepD基因,并在此基因中间插入潮霉素抗性基因(hph)表达单元,由此产生了3.7kb的pepD阻断基因片段。将此阻断基因片段与载体pBS连接,构建成pepD基因阻断质粒pBSDH。采用原生质体-CaCl₂/PEG法将酶切阻断质粒得到的含pepD基因和hph表达单元的3.7kb线性片段转化AspergillusnigerGICC2773菌株,在含潮霉素的平板上筛选潮霉素抗性转化子,从这些抗性转化子中经PCR检测分离到到1个pepD基因阻断突变菌株?pepD66。外源漆酶分泌活性分析显示,黑曲霉pepD基因的破坏使其外源漆酶的分泌表达有所提高。     

CD4同源二聚化或寡聚化的间接检测及其介导的生物学功能的初步分析

近年来的研究表明 ,CD4分子于细胞膜表面不仅以单体形式存在还可以通过其D4和D1形成同源二聚化及寡聚化 ,并且二聚化及寡聚化的CD4分子才能稳定地与MHC Ⅱ类分子结合。通过分析CD4分子以及CD4缺失突变体分子融合Fas基因片段所诱导的转染靶细胞的凋亡 ,以及携带绿色荧光蛋白的CD4分子转染HEK2 93细胞所筛选出的稳定克隆的不同荧光强度和与MHC Ⅱ类分子阳性细胞Raji之间的不同黏附效应间接鉴定CD4同源二聚体或寡聚体的存在 ,并对二聚化或寡聚化CD4分子所介导的生物学功能进行初步分析。     

基于Cyt b基因探讨羚羊亚科原羚属系统发生关系

原羚属物种在羚羊亚科中的分类地位尚存在很多争议。本文测定了原羚属的黄羊和藏原羚细胞色素b基因全序列(1140bp),并与牛科其它属31个种的同源序列进行比较,对其碱基组成变异情况及核苷酸序列差异进行了分析。基于细胞色素b基因全序列,用简约法(MP)、邻接法(NJ)和似然法(ML)构建了系统进化树。结果表明：黄羊和藏原羚的序列差异为3．78％,颠换数目近乎为0,其突变远未饱和;原羚属内黄羊和藏原羚为不同种,单系发生;原羚属与赛加羚羊属、犬羚属及跳羚属等并系发生,原羚属隶属于羚羊亚科,应为独立属;羚羊亚科组成属间多为并系起源。根据序列差异值2％／百万年的细胞色素6分子钟,推测黄羊和藏原羚分歧时间大约为1～2百万年;原羚属与羚羊亚科其它属分歧时间大约在5．7～8百万年。     

Red/ET 同源重组介导细菌人工染色体的快速修饰

随着基因组测序工程的实施与完成,如何对包含完整基因信息的特定细菌人工染色体 (BAC) 进行有目的修饰,已成为功能基因组学研究的一个重要环节 . 应用新近优化的 Red/ET 同源重组技术对目标 BAC 进行修饰,以 pSC101-BAD-gbaA 为依托质粒,采用 rpsL-neo 为正 / 反向筛选系统,可以快速、高效地对 BAC 进行剪切、插入、替换等操作,其中能够进行抗性筛选的一步 BAC 修饰只需一周时间,以插入非抗性标记基因 Cre 为代表的两步 BAC 修饰在两周内即可完成 . 通过阿拉伯多糖诱导调控和简单地变化培养温度,能使 pSC101-BAD-gbaA 依托质粒在发挥完 Red/ET 同源重组作用后自然消失,最终获得完整而纯净的修饰后 BAC ,为加快功能基因组学研究提供了一个可靠的实验平台 .     

c-Abl蛋白酪氨酸激酶形成同源二聚体

c-Abl是非受体酪氨酸激酶,它在细胞内被一些基因毒性的、氧化的及其它形式的压力所激活。目前研究证明：应用标记的c-Abl发现其在细胞内可以相互形成同源二聚体,并且一分子c-Abl的N末端区域与相应的另一分子的C末端相互作用形成二聚体。实验进一步表明： cAbl SH3 结构域结合到另一c-Abl 分子富含脯氨酸的C-末端约958-982氨基酸区域。如果去除c-Abl 富含脯氨酸的结构域,就会阻止二聚体的形成。这些结果首先证实了c-Abl在细胞内可以相互形成同源二聚体,并暗示着二聚体的形成可能影响着c-Abl活性的调节。     

人类新基因WDR70的克隆及初步研究

运用基于基因组数据库的特定基因同源新基因的克隆策略得到一个人类新基因WDR70 ,该基因编码一个包含 12个WD4 0结构域的蛋白。WDR70的cDNA序列长 2 2 6 6bp ,预测编码蛋白含 6 30个氨基酸 ,理论分子量为 70× 10 3 u ,染色体定位为 17p13.1。以小鼠胚胎为模型进行整体原位杂交 ,结果显示WDR70基因在 8.5d小鼠胚胎中没有表达 ,而在 9.5d和 10 .5d的小鼠胚胎的脑部有特异表达。由此推断该基因对胚胎期脑部的发育有重要的影响。     

通过同源重组构建酿酒酵母新型表达质粒

利用同源重组的方法, 构建了具有高拷贝数和高稳定性的新型酿酒酵母表达质粒. 对酵母附加体型载体pHC11进行一系列改造, 得到质粒pHC11R, 并用适当的酶切线性化; 利用PCR反应得到人IFNα2b表达单元片段, 它的两端和线性化的pHC11R的两端具有50 bp左右的同源区段. 上述两个片段共转化酿酒酵母, 在酵母体内经同源重组后得到表达质粒pHC11R-IFNα2b, 该表达质粒与 pHC11-IFNα2b相比去除了质粒上用于在大肠杆菌中复制和筛选所需的序列, 在宿主菌中的稳定性和拷贝数均有明显提高, 同时外源基因的表达量也获得了一定程度的提高. 在此基础上, 进一步构建了带有不同表达元件的pHR系列载体, 使得外源基因能够通过同源重组在酿酒酵母中快速、方便地克隆和表达.     

藏鸡胚胎的低氧适应特征及其血红蛋白突变效应

藏鸡能在4200 m以上海拔正常繁衍生息, 但低地鸡在模拟4200 m海拔(12.0%O₂)条件下孵化却只有3.0%的孵化率. 在两品种全期低氧和阶段低氧模拟孵化实验中, 4200 m全期低氧揭示4~11天是隐性白与藏鸡阶段存活率相差最悬殊的阶段, 12~21天相差极显著, 1~3天相差不显著. 但4200 m阶段低氧只能造成两品种孵化率显著差异, 而并不足以造成低氧阶段间阶段死亡率显著差异, 结果显示藏鸡具有优越的克服低氧损害后期不良影响的能力. 对藏鸡和隐性白鸡血红蛋白7条链全部编码序列进行多态分析, 筛选到α^D链编码基因的一个低氧功能突变位点(Met- 2D(B13)-Leu). 该突变基因为藏鸡独有, 其频率随着海拔升高而升高, 而且该突变基因频率越高的群体, 孵化率越高. 以鸡的HbD晶体为模板, 对突变血红蛋白结构和功能进行了同源预测, 结果表明Leu替代Met提供了一个更疏水环境, 有利于血红素的稳定, 从而提高了血红蛋白的血氧亲和力. 突变(Met-32D(B13)-Leu)发生的时间和地点与藏鸡家养化时间和地点密切相关.     

用放射杂交板定位鸡的MC4R基因以及其在鸡和人染色体上同源区的比较分析

黑素皮质素受体(melanocortin-4 receptor,MC4R)基因的突变与猪、鼠和人等的食欲、肥胖和生长有关联性,然而对鸡的MC4R基因的功能却知之甚少。为了确定鸡的MC4R基因在染色体上的位置,使用鸡-仓鼠杂交板(ChickRH6)做了该基因的定位工作。通过扩增ChickRH6杂交板上的93个样品,然后经整合分析将mC4R基因定位在2号染色体上的标记MCW0062、BCL2和OVY附近,即2q12。这个连锁图上的5个标记基于两点分析与MC4R的LOD值都大于5。同时,以MC4R基因为标记做了鸡和人的染色体比较分析。结果显示鸡的2号染色体(GGA2)和人的18号染色体(HSA18)存在同源区,且基因BCL2和肥胖基因(obesity)位于MC4R基因附近。推测鸡的MC4R基因与人的MC4R基因可能具有相似的功能。该研究揭示了鸡和人MC4R基因的染色体分布,并用杂交放射板将鸡的MC4R基因定位在2号染色体的12区带。     

大肠杆菌ptsG基因敲除及其缺陷株生长特性研究

在大肠杆菌磷酸转移酶系统中,葡萄糖主要由ptsG基因编码的酶ⅡCB^Glc转运入细胞。利用代谢工程技术构建ptsG基因缺陷株,有望降低葡萄糖的摄取速率,减少乙酸累积,促进菌体生长。运用PCR技术,扩增出两翼与ptsG基因上下游序列同源,中间为氯霉素抗性基因的DNA片段。经电转化,将外源DNA片段分别转入Escherichia coli DH5α、JM109中。在Red重组酶的作用下,外源DNA片段与染色体上同源区域重组,将基因ptsG敲除,构建ptsG基因缺陷株DH5αP、JM109P。在LB培养基中,ptsG基因缺陷株的生长状况与亲株无明显差异。在含有葡萄糖的LB培养基中,DH5αP、JM109P的最高菌密度分别是对照菌株DH5α、JM109的3.47倍和4.25倍,ptsG基因缺陷株对葡萄糖的摄入量也明显高于对照菌株。重组蛋白肿瘤坏死因子（TNF）在DH5αP、JM109P中的表达量分别占全菌蛋白的24.3%、20.8%,A600分别为8.28、7.62,TNF在缺陷株中单位体积的表达量明显高于对照菌株。以上结果说明,大肠杆菌ptsG基因缺陷株具有良好的生长能力和表达外源蛋白的能力,在大肠杆菌高密度发酵研究方面具有良好的应用前景。