东北林蛙抗菌肽dybowskin-1ST的结构预测及生物学活性分析

运用生物信息学方法进行东北林蛙抗菌肽dybowskin-1ST的进化、结构及抗原表位预测,分析其抑菌机理及结构性质,应用小鼠伤口愈合实验及体外抑菌实验进行活性验证。同时为改良亲本肽、进行新型衍生肽的研发提供理论基础。使用软件MEGA_X对dybowskin-1ST及其他蛙类抗菌肽进行同源性比对并绘制系统进化树;通过在线软件ProtParam、ProtScale、PeptideCutter、SignalP、TMHMM Server分别预测抗菌肽dybowskin-1ST的理化参数、亲/疏水性、剪切位点、信号肽及跨膜区域;分别应用 SOPMA、Jpred4及DNAstar Protean软件多重分析预测dybowskin-1ST的二级结构,利用SWISS-MODEL和I-TASSER软件进行三级结构预测。通过在线软件ABCpred和SYFPEITHI进行T/B抗原表位预测。构建小鼠伤口模型,观察dybowskin-1ST促进伤口愈合活性。应用纸片法及96孔板法,确定dybowskin-1ST的抑菌活性。抗菌肽dybowskin-1ST含有59个氨基酸,其中亮氨酸占16.9%,分子式为C318H510N80O93S2,理论等电点为5.10,电荷量为?2。抗菌肽dybowskin-1ST与东北林蛙抗菌肽dybowskin-1CDYa亲缘较近。三种方法二级结构预测结果相似,dybowskin-1ST中α-螺旋、延伸链、β-转角、无规卷曲,所占比例分别为44.07%、16.95%、3.39%、35.39%。三级结构预测中显示该抗菌肽大部分为α-螺旋结构,抗菌肽dybowskin-1ST总体预测为亲水性蛋白,具有信号肽序列。亚细胞定位分析显示,其分泌线粒体靶向肽的可能性为0.944。该蛋白属于膜外蛋白,无跨膜结构区,有7个磷酸化位点,3个T细胞抗原表位和8个B细胞抗原表位。dybowskin-1ST具有促进伤口愈合的作用,能够有效抑制大肠杆菌和金黄色葡萄球菌活性,但对真菌及耐药菌的抑菌活性有限。dybowskin-1ST结构中虽富含α-螺旋,但验证实验表明其抑菌能力仍有待加强,原因可能是由于其带负电荷且为亲水性蛋白,以提高正电荷数及改变疏水性为基本思路进行氨基酸改造可获得活性升级的衍生肽。     

1株解淀粉芽胞杆菌的常压室温等离子诱变及其发酵优化

为提高解淀粉芽胞杆菌(Bacillus amyloliquefaciens)TXM-A2对镰刀菌的抑菌作用,利用常压室温等离子(Atmospheric Room Temperature Plasma, ARTP)诱变技术处理菌株TXM-A2,以禾谷镰孢菌(Fusarium graminearum)为筛选指示菌,获得1株诱变株AR7,其对禾谷镰孢菌的抑制率提升了33.15%。经过5次传代培养,该诱变株的遗传稳定性良好。以诱变株的OD_(600)及无菌滤液对尖孢镰刀菌(Fusarium oxysporum)的抑制作用为检测指标,采用单因素试验优化发酵培养基,最优配方为葡萄糖10 g/L,酵母浸粉25 g/L,NaCl 5 g/L,优化后OD_(600)由3.250增加至5.543,对尖孢镰刀菌的抑菌直径由2.833 cm增加至3.027 cm。进一步对诱变株进行不同转速条件5 L罐分批发酵,最大活菌数可达1.65×10~9 cfu/mL。利用ARTP技术筛选的诱变株对镰刀菌有较好拮抗作用,扩大培养后活菌数上升,可为生物防治剂开发提供参考。     

灰黄霉素片微生物限度检查方法研究

目的:建立灰黄霉素片的微生物限度检查方法。方法:采用五种阳性对照菌进行回收率试验,确定供试品的抑菌情况,从而选择消除方法。结果:本品对霉菌和酵母菌有抑菌作用,需采用薄膜过滤法才能消除其抑菌作用,回收率均可达70%以上。结论:蒙欣生产的灰黄霉素片采用平皿法检查细菌数,薄膜过滤法检查霉菌和酵母菌数,常规法检查控制菌数。     

微波辅助水提梓树根皮中抑菌成分的研究

本实验采用微波水提的方法研究梓树根皮中水提物的抑菌成分。以枯草芽孢杆菌为指示菌,用单因素及正交实验选择最佳提取工艺条件,研究了微波辅助水提梓树根皮中抑菌成分。结果表明,当微波功率300 W,提取时间9 min,料液比1∶10,温度40℃,梓树皮中抑菌化合物的抑菌圈的大小可达到17.2 mm。     

罗汉果果实总黄酮的含量变化及其抑菌作用

以30％乙醇溶液作提取剂,在超声波功率250W的条件下进行正交试验,结果表明,超声波辅助提取罗汉果果实中总黄酮的最佳条件为料液比1∶9、提取温度80℃、提取时间40 min,在此条件下总黄酮提取率最高,为2.86％.罗汉果果实在10月上旬至12月下旬的生长成熟过程中,总黄酮的含量变化表现为初期逐渐上升,至12月上旬达到最高值,其后快速下降.抑菌实验表明,罗汉果果实中的黄酮类物质对枯草芽胞杆菌、产气杆菌、藤黄八叠球菌和白色念球菌等革兰氏阳性菌的生长具有较显著的抑制作用,而对大肠杆菌、变形杆菌以及青霉和黑曲霉没有抑制作用.     

稻瘟病拮抗菌的筛选及抑菌活性的研究

利用对峙法和牛津杯法从大连近海海域分离得到1株对稻瘟病菌有拮抗作用的菌株BCHN-15,经生理生化实验和16S r DNA方法鉴定,该菌株为解淀粉芽胞杆菌。实验结果显示,BCHN-15能显著抑制稻瘟病菌的生长,与稻瘟病菌作用48 h后,稻瘟病菌的菌丝干重与对照组相比减少了74.36%。该菌产生的抑菌成分可破坏稻瘟病菌的细胞膜,且对热稳定,其活性成分能被盐酸沉淀。结果表明,BCHN-15可通过破坏稻瘟病菌的细胞膜,引起菌丝畸形和断裂来发挥其抑菌作用。     

绿茶粗提物对耻垢分枝杆菌的生长抑制研究

采用乙酸乙酯在中性条件下萃取绿茶,得到含有表没食子儿茶素没食子酸酯(Epigallocatechin gallate,EGCG)的粗提物。通过纸片琼脂扩散法和细菌生长曲线来评价绿茶粗提物对耻垢分枝杆菌的抑菌效果,利用透射电子显微镜(Transmission electron microscopy,TEM)观察其对耻垢分枝杆菌细胞壁结构的影响。结果显示,绿茶粗提物对耻垢分枝杆菌生长产生明显抑制作用,且抑菌作用随着浓度的升高逐渐加强;经绿茶粗提物处理的耻垢分枝杆菌细胞壁呈现膨出、变形等形态学变化。因此,绿茶粗提物具有抑制耻垢分枝杆菌生长的功能,其作用机制可能与其主要成分EGCG影响细胞壁肽聚糖的生物合成有关。     

烟草根黑腐病拮抗内生细菌的筛选及其抑菌作用

【目的】从烟草根、茎中分离获得对烟草根黑腐病菌(Thielaviopsis basicola)有较好控病作用的内生细菌。【方法】采用平板对峙培养,测定分离获得的306个内生细菌对烟草根黑腐病菌的抑制作用;通过菌株形态特征、生理生化特性及16S rDNA序列对菌株进行分类鉴定。【结果】筛选获得6个菌株对烟草根黑腐病菌有较强拮抗作用,室内测定其对病原菌的抑菌带宽达6.5 mm-11.0 mm,温室控病效果达11.9%-77.1%,其中来自茎部的内生细菌T295菌株对烟草根黑腐病的防效达77.1%;无菌滤液实验表明,拮抗内生细菌T295无菌滤液在实验浓度范围内对病菌菌丝生长、孢子萌发有较好地抑制作用。【结论】菌株T295对烟草根黑腐病具有较好的防治作用,经鉴定为枯草芽孢杆菌(Bacillussubtilis)。     

大青叶和板蓝根提取物的抑菌作用研究

目的：探讨中药大青叶和板兰根的逐级提取物的抑菌作用。方法：采用试管稀释法测定大表吉和板兰根的各级提取物－总浸液、乙醇提取液、正丁醇萃取液对各实验菌的最小抑菌浓度（MIC）。结果：各级提取物对实验菌分别有不同程度的抑菌作用,其中对金黄色葡萄球菌的抑菌作用最为明显;各提取物的抑菌强度依次为：正丁醇萃取液（对三种实验菌均明显抑制：MIC≤62mg/ml)、乙醇提取液（金黄色葡萄球菌：MIC≤62mg/ml、肠炎杆菌：MIC≤125mg/ml、大肠埃希菌MIC≤500mg/ml)、总浸液（仅对金黄色葡萄球菌抑制明显：MIC＝62mg/ml）。结论：大青叶和板蓝根具有广谱抗菌作用,其逐级提取物富集的抑菌活性逐级增强。     

木梨幼叶提取物抑菌作用研究

用木梨(yrus xerophila)幼叶提取物对几种常见微生物进行抑菌试验,结果表明：木梨幼叶提取物对多种微生物有明显的抑制作用,对金黄色葡萄球菌、大肠杆菌、枯草杆菌及青霉菌的最低抑菌浓度分别为0．25％,4％,4％,8％,且能耐高温短时的热处理。