气味结合蛋白OBPs在意大利蜜蜂头部表达模式的研究

昆虫气味结合蛋白(OBPs)是脂溶性化学物质的载体,参与了嗅觉识别和化学传输等生理过程.本研究利用MEME在线软件对意大利蜜蜂Apis mellifera ligustica OBPs基因家族21条氨基酸序列进行Motif预测分析;采用RT-PCR初步筛选出在意大利蜜蜂头部表达量较高的OBPs基因,然后利用qPCR技术对筛选出的基因进一步分析其在不同日龄内勤蜂头部的表达情况.结果 表明,在预测获得的6个motif中,motif1为21个OBPs所共有,具有极高的保守性,推测该序列元件可能是意大利蜜蜂OBPs与底物结合的区域;表达谱分析结果表明,13个OBPs基因的凝胶电泳条带明显(即在头部的表达量较高),且大多数基因在4日龄时表达量达到最高值,推测这类蛋白可能参与了幼虫信息素和糖类物质的识别过程.本研究结果丰富了蜜蜂OBPs表达特性的研究数据,同时也为探讨昆虫OBPs广泛的生理功能奠定了基础.     

基于Illumina HiSeq测序技术研究吡虫啉对意大利蜜蜂雄蜂的影响

[目的]雄蜂对蜂群繁衍有着非常重要的作用.本研究旨在探究吡虫啉对意大利蜜蜂Apis mellifera Ligustica雄蜂生长发育和基因表达产生的影响.[方法]以意大利蜜蜂雄蜂为研究对象,分别以0.00001、0.0001和0.001 μg/μL浓度的吡虫啉对雄蜂幼虫进行连续饲喂处理.每天观察并记录幼虫的发育形态及死亡率,在雄蜂幼虫后期(移虫后6d)测量幼虫体重.利用Illumina HiSeq测序技术对经吡虫啉处理的雄蜂进行转录组测序,进而对差异表达基因进行深入分析.[结果]取食吡虫啉后的雄蜂幼虫,体重低于正常雄蜂,当浓度高于0.0001μg/μL时差异显著;雄蜂幼虫取食吡虫啉后出现死亡现象,且死亡率随吡虫啉浓度的升高而增大;差异表达基因分析结果上调与下调基因数量分别为390个和130个.GO富集分析结果上调基因共分布于55个GO条目,富集基因数量最多的是细胞进程、细胞、细胞组件、细胞膜、细胞膜组件、结合,下调基因共分布于48个GO条目,富集基因数量最多的是细胞进程、细胞、细胞组件.富集在有关生殖功能的差异表达基因中,上调基因数量为21个,下调基因数量为5个.KEGG代谢通路富集分析结果上调基因富集在159个通路上,其中富集基因数最多的是蛋白质消化吸收和神经活性配体-受体相互作用通路.下调基因富集在71个通路上,其中富集基因数最多的是溶酶体、胰液分泌、神经活性配体-受体相互作用通路.[结论]吡虫啉能抑制意大利蜜蜂雄蜂的生长发育,甚至造成幼虫死亡,同时,可以影响雄蜂的神经系统、代谢系统和生殖系统等.本研究结果为蜜蜂资源保护提供理论依据.     

蜂王上颚腺信息素对雄蜂候选性信息素受体基因表达的影响

【目的】性信息素受体(sex pheromone receptors, PRs)是雄蜂感受蜂王上颚腺信息素(queen mandibular pheromone, QMP)的重要受体。本研究分析中华蜜蜂Apis cerana cerana(简称"中蜂")和意大利蜜蜂Apis mellifera ligustica(简称"意蜂")雄蜂触角和大脑中候选性信息素受体基因Prs受QMP刺激下的表达特征,为探索蜜蜂气味受体(OR)基因的功能研究提供理论依据。【方法】利用qRT-PCR技术检测分析分别用10μL QMP[7.04μg/μL反式-9-氧代-2-癸烯酸(9-ODA)+1.26μg/μL 9-羟基-2-癸烯酸(9-HDA)+0.03μg/μL对羟基苯甲酸甲酯(HOB)]和10μL 7.04μg/μL 9-ODA处理对飞行状态和爬行状态下的中蜂雄蜂和意蜂雄蜂触角和大脑中4个气味受体基因(Or10,Or11,Or18和Or170)的mRNA表达量的影响。【结果】与空白对照组相比,QMP及9-ODA均能显著下调中蜂雄蜂和意蜂雄蜂触角与大脑中Or11的mRNA表达量;中蜂雄蜂触角中AcOr18和AcOr170基因受QMP及9-ODA刺激后mRNA表达量显著下调;QMP与9-ODA均能显著降低中蜂雄蜂和意蜂雄蜂大脑中Or170的mRNA表达量。在QMP或9-ODA刺激下,飞行中蜂雄蜂大脑中AcOr11的mRNA表达量显著高于爬行中蜂雄蜂大脑中的,而飞行与爬行中蜂雄蜂触角中AcOr11的mRNA表达量没有显著差异。【结论】中蜂和意蜂雄蜂触角与大脑中气味受体基因Or11均能应答蜂王上颚腺信息素9-ODA,且受9-ODA刺激后Or11的mRNA表达下调。     

转录组分析揭示东方蜜蜂微孢子虫侵染意大利蜜蜂的分子机制

【目的】本研究旨在通过差异表达基因(differentially expressed gene, DEG)分析以及毒力因子和其他侵染相关因子分析,在转录组水平揭示东方蜜蜂微孢子虫Nosema ceranae侵染意大利蜜蜂Apis mellifera ligustica的分子机制。【方法】基于前期已获得高质量的东方蜜蜂微孢子虫纯化孢子(NcCK)及侵染意大利蜜蜂工蜂7和10 d的东方蜜蜂微孢子虫(分别为NcT1和NcT2)转录组数据,根据P≤0.05且|log_2(Fold change)|≥1的标准,通过比较分析筛选出NcCK vs NcT1, NcCK vs NcT2和NcT1 vs NcT2比较组的DEG。通过相关生物信息学软件对上述DEG进行Venn分析、GO分类和KEGG代谢通路富集分析。根据Nr和KEGG数据库注释信息和相关文献进行对东方蜜蜂微孢子虫的毒力因子和侵染相关因子的统计和分析。通过RT-qPCR验证转录组数据及DEG表达趋势。【结果】从NcCK vs NcT1, NcCK vs NcT2和NcT1 vs NcT2比较组分别鉴定出1 397, 1 497和52个DEG。Venn分析结果显示各比较组共有的上调和下调基因分别为10和1个。GO分类结果显示,NcCK vs NcT1和NcCK vs NcT2中DEG富集数最多的功能条目为代谢进程、细胞进程、单组织进程、细胞、细胞组件、细胞器、催化活性和结合,而NcT1 vs NcT2中DEG富集数最多的是代谢进程、细胞进程、单组织进程、催化活性和结合。KEGG代谢通路富集分析结果显示,NcCK vs NcT1和NcCK vs NcT2中DEG分别富集到80和79条通路;富集在糖酵解/糖异生和MAPK信号通路的上调基因数量多于下调基因。毒力因子分析结果显示,孢壁蛋白9基因和孢壁蛋白12基因在NcCK vs NcT1和NcCK vs NcT2中均下调表达,孢壁蛋白8基因仅在NcCK vs NcT1中表达量下调;此外孢壁蛋白前体基因、孢壁和锚定盘复合蛋白基因、几丁质合酶基因、极管蛋白基因、蓖麻毒素B凝集素基因的表达水平在NcCK vs NcT1和NcCK vs NcT2中表现为上调。侵染相关因子分析结果表明,糖酵解途径的3个关键酶基因在NcCK vs NcT1和NcCK vs NcT2中上调表达;3个涉及ATP/ADP移位酶的基因在NcCK vs NcT1和NcCK vs NcT2中上调表达,但有1个表达量下调;2个涉及ABC转运蛋白的基因在NcCK vs NcT1和NcCK vs NcT2中上调表达,另有4个下调表达。RT-qPCR结果证实了本研究中转录组数据及DEG表达趋势的真实可靠性。【结论】本研究通过比较分析解析东方蜜蜂微孢子虫侵染意大利蜜蜂工蜂过程的转录组动态,揭示了孢壁蛋白、孢壁和锚定盘复合蛋白、几丁质酶、极管蛋白和蓖麻毒素B凝集素等毒力因子编码基因,以及己糖激酶、丙酮酸激酶、6-磷酸果糖激酶、ATP/ADP移位酶和ABC转运蛋白等侵染相关因子编码基因在病原增殖中扮演重要角色,为阐明东方蜜蜂微孢子虫的侵染机制提供了基础。     

吡虫啉胁迫对意大利蜜蜂哺育蜂免疫解毒相关基因表达及酶活力的影响

蜜蜂作为世界上最重要的授粉性昆虫,在采集过程中易接触到杀虫剂,前人研究表明新烟碱类杀虫剂吡虫啉（imidaclorprid）影响意大利蜜蜂Apis mellifera ligustica（简称“意蜂”）的存活和舞蹈、采集等行为。本研究旨在探究亚致死剂量吡虫啉胁迫对意大利蜜蜂哺育蜂（8日龄成年工蜂）免疫解毒相关基因表达、免疫解毒酶系活力及存活率的影响。结果显示哺育蜂连续取食3 d和9 d含0.1 ng/μL吡虫啉的蔗糖液后,其存活率与对照组（饲喂含等量丙酮的蔗糖溶液）无显著差异;连续饲喂11 d含0.1 ng/μL吡虫啉的50%蔗糖溶液后,其存活率与对照组有显著差异。荧光定量PCR检测及双抗体一步夹心法酶联免疫吸附试验结果显示哺育蜂取食吡虫啉3 d后,蜜蜂体内免疫基因多酚氧化酶基因（PPOA3,GB43738）,Abaecin类抗菌肽基因（ABA,GB18323）,葡萄糖脱氢酶基因（GLD, GB43007）和解毒基因细胞色素P450基因（CYP450 6a2,GB49876）,细胞色素B561基因（CYB561 2-like,GB40148）,葡萄糖醛酸转移酶（UDP-glucuronosyltransferase,GB52179）的表达及蜂体内体内细胞色素P450酶（cytochrome P450,CYP450）含量均有上调趋势,超氧化物岐化酶（superoxide dismutase,SOD）和过氧化氢酶（catalase,CAT）均有显著下调趋势;哺育蜂取食吡虫啉9 d后,PPOA3,ABA,GLD,CYP450 6a2,CYB561 2-like,UDP-glucuronosyltransferase的表达及蜂体内体内细胞色素P450酶含量均有下调趋势,多酚氧化酶（polyphenol oxidase,PPO）,超氧化物歧化酶和过氧化氢酶酶活力均有显著下调趋势。本研究在分子水平上提供了亚致死剂量吡虫啉是通过扰乱蜜蜂正常的免疫系统进而影响蜜蜂行为的证据,以期为维护蜜蜂健康提供一定的理论依据。     

意大利蜜蜂甘油醛-3-磷酸脱氢酶基因amGAPDH2的cDNA克隆与序列分析

应用RT-PCR技术克隆了意大利蜜蜂(Apis mellifera)甘油醛-3-磷酸脱氢酶基因amGAPDH2,利用MEGA5.1、DNAMAN、PredictProtein和I-TASSER等软件对该基因进化关系以及其所对应的蛋白的同源性、理化性质和结构进行了预测和分析。从意大利蜜蜂cDNA文库中克隆得到了长1188 bp的amGAPDH2序列,GenBank登录号为MH152402。该序列具有完整的开放阅读框(ORF,114~1115 bp),其编码333个氨基酸。该基因编码的氨基酸序列与其它昆虫的GAPDH有较高的序列相似性(80%以上),系统进化分析表明amGAPDH2与中华蜜蜂、小蜜蜂的序列相似性最高。利用ProtParam等软件对amGAPDH2编码的蛋白质分析结果显示,amGAPDH2属于不稳定、亲水性蛋白;二级结构属于混合型,Helix占25.53%、Strand占24.62%、Loop占49.85%;am GAPDH2具有两个保守结构域:一个是N端的NAD(P)结合结构域,另一个是C端的催化结构域Gp_dh_C。该研究为后期amGAPDH2基因的生理功能研究提供了理论依据。     

枣花病对意大利蜜蜂消化酶和解毒酶系活性的影响

[目的]枣花期蜜蜂易发生枣花中毒(又称枣花病),致使大量采集蜂死亡.本研究初步探讨了枣花病对蜜蜂的毒性作用机理.[方法]以正常的意大利蜜蜂Apis mellifera ligustica工蜂为对照,采用分光光度法测定山西临猗、太谷和临县患枣花病的意大利蜜蜂工蜂体内淀粉酶、蛋白酶、蔗糖酶、果胶酶、海藻糖酶、酯酶(este...     

不同蜂在温室草莓园的访花行为和传粉生态学比较

应用意大利蜜蜂、本土小峰熊蜂和引自欧洲的地熊蜂3种蜂在北京为温室草莓传粉,对其传粉行为和生态特性进行研究。结果表明:意大利蜜蜂的出巢温度、工作起点温度、平均单花停留时间和访花间隔时间均显著高于小峰熊蜂和地熊蜂(P<0.01),而这些行为在2种熊蜂之间差异不显著(P>0.05);3种蜂携带花粉回巢的比例依次为意大利蜜蜂>小峰熊蜂>地熊蜂,而其携带的花粉活性依次为意大利蜜蜂>小峰熊蜂=地熊蜂;2种熊蜂开始活动的时间比意大利蜜蜂早,日活动时间比意大利蜜蜂长;地熊蜂在一天中的活动频率最高(P<0.01);经3种蜂授粉的草莓果实营养品质差异不显著(P>0.05),与对照相比也无差异,而经过3种蜂授粉的草莓果实畸形率降低、单果质量增大;经2种熊蜂授粉的草莓果实畸形率低于意大利蜜蜂(P<0.05)。本土小峰熊蜂能够有效替代意大利蜜蜂或地熊蜂为温室草莓授粉。