基于核酸自组装纳米结构的siRNA药物递送研究进展

RNA干扰(RNA interference,RNAi)作为转录后调节机制,可靶向mRNA进行剪切降解从而发挥基因沉默效应.siRNA (small interference RNA)因其高效性和特异性而被广泛应用于药物研究中.目前,研究者们已开发了多种阳离子载体用于siRNA递送.但由于siRNA双链结构具有相对较强的刚性结构,且阴离子电荷密度较低,无法与阳离子载体形成稳定、致密的复合物,使得siRNA的应用仍面临诸多挑战,如细胞摄取率低、靶向特异性差、递送过程不稳定、潜在的细胞毒性以及易诱发免疫反应等.近年来,核酸自组装纳米结构由于其结构灵活且负电荷密度较高而受到广泛关注,有望实现siRNA药物的高效递送和基因沉默.本文综述了近年来基于核酸自组装纳米结构的siRNA递送的研究进展及其应用.     

滇西北高原湿地景观变化与人为、自然因子的相关性

人为活动的干扰与自然因子的变化共同作用于湿地生态系统,但两者对湿地生态系统作用的贡献率存在差异,目前尚缺乏进一步的研究。本研究基于面向对象分割和目视解译相结合的技术方法,研究了滇西北高原典型湿地纳帕海汇水区内28年来(1987—2015年)的湿地类型、分布及其空间格局的变化特征,并探讨其与当地人为活动的干扰(主要社会经济发展指标)、自然因子(主要气候因子)之间的相互关系。结果表明:(1)湿地总面积共计减少2456.46 hm~2,其中,原生沼泽、沼泽化草甸和草甸面积分别减少了1152.07,1257.72,202.74 hm~2,湖泊面积增加了156.07 hm~2;(2)湿地景观多样性发生显著变化,其中,斑块数量(NP)由1987年的221增加到2005年的299,随后减少到2015年的260;香农多样性指数(SHDI)由1987年的1.81增加到1999年的1.84,随后减少到2015年的1.75;聚集度指数(contagion index)由1987年的52.82减少到1999年的52.02,随后增加到2015年的53.49;(3)湿地分布面积和香农多样性指数与第一、二、三产业值,以及年均温度呈负相关,与降水量呈正相关;斑块数量、聚集度指数均与第一、二、三产业值,以及年均温度呈正相关,与降水量呈负相关;(4)社会经济发展主要指标对湿地面积和景观多样性指数变化的解释度为63.50%,气候因子对其的解释度为36.50%。整体上,人为活动的干扰是导致该区域湿地不断萎缩、景观多样性改变的关键驱动力。减缓人为活动对湿地生态系统的过度影响,是当地保护湿地资源、维护湿地生态功能的关键。     

Txnip基因siRNA慢病毒表达质粒构建及促进猪前体脂肪细胞分化

硫氧还蛋白互作蛋白(thioredoxin interacting protein, Txnip)是一种氧化还原调节蛋白质,与硫氧还蛋白结合并抑制其活性,调节细胞氧化还原状态,影响细胞多种生理过程,然而其在猪脂肪细胞分化中的作用尚不明确。本文设计合成3对靶向猪Txnip基因的shRNA寡核苷酸,分别连接于重组慢病毒载体pGLV_3/H_1/GFP+Puro构建siRNA表达质粒。测序验证后,与包装质粒共转染293T细胞,获得滴度1×10~8 pfu/mL的慢病毒干扰质粒。以MOI值100转染原代培养猪前体脂肪细胞,转染率均达80%以上,其中Txnip-shRNA-2转染细胞Txnip基因沉默率达75%。转染Txnip-shRNA-2的猪前体脂肪细胞用成脂分化培养液诱导后,每隔1 d检测细胞成脂分化及相关基因表达。结果发现,其分化比阴性对照质粒转染或未转染细胞显著增强(P<0.05),PPARγ和FAS mRNA表达水平显著提高(P<0.05)。本文构建siRNA慢病毒表达质粒能有效干扰猪Txnip基因表达,Txnip表达沉默可通过上调PPARγ表达促进猪前体脂肪细胞分化。本研究提示,Txnip可能是猪脂肪细胞分化的抑制因子。     

不同干扰模式对受害马尾松人工纯林林分结构的影响

在浙江安吉选择松材线虫病危害的马尾松人工纯林,分别进行暂不采伐直至10年后统一伐除受害木的集中干扰、采伐受害松木的适度干扰、采伐受害松木与周边松木及生长势弱松木的强度干扰,探讨不同干扰模式使受害马尾松林恢复健康的可能性.16年后的试验结果表明: 3种模式下受害林分马尾松的重要值为集中干扰>适度干扰>强度干扰,阔叶树的重要值则正好相反;与集中干扰相比,适度和强度干扰后的马尾松、阔叶树的平均胸径分别提高1.2、1.7倍和1.3、1.9倍,平均树高分别提高了1.5、2.0倍和1.2、1.8倍,林分每公顷蓄积量分别是集中干扰样地的5.2和3.8倍;适度和强度干扰的各径阶株数均远高于集中干扰样地,胸径结构近似于反J型曲线,也形成了复层林,物种丰富度和多样性指数均显著高于集中干扰样地,林木个体差异及林分复杂性指数均表现为适度干扰>强度干扰>集中干扰.适度和强度干扰下单层马尾松同龄纯林均演替为复层马尾松-阔叶树混交异龄林.3种模式均是正向阔叶化演替,演替速度为强度干扰>适度干扰>集中干扰.表明适度干扰更有利于病害马尾松林分恢复,间伐马尾松纯林能加快阔叶混交化进程以抵御松材线虫病的入侵.     

火烧高温对泥炭藓孢子萌发力影响的模拟实验

作为生态系统稳定性维持的一个重要因素,火对泥炭地优势植物泥炭藓(Sphagnum)孢子库的影响尚不清楚.以采自长白山区泥炭地的泥炭土和3种泥炭藓的成熟孢子为实验材料,室内模拟火烧,以此设置不同温度水平(20、40、60或100℃,持续0.5、1、2、4或10 min),对泥炭藓孢子进行热激处理,经萌发实验后,研究火烧高温对孢子萌发率的影响.结果显示,火烧期间各层土温随深度而递减,表层泥炭可达300℃的极端高温,而1 cm深温度仅为70℃,体现出泥炭土良好的热缓冲性;40℃的热激可使锈色泥炭藓(S.fuscum)与中位泥炭藓(S.magellanicum)孢子萌发率提高20%与50%;60℃的热激使尖叶泥炭藓(S.capillifolium)孢子的萌发率提高1倍;100℃热激对3种泥炭藓孢子萌发则有强烈的抑制作用.研究表明,泥炭藓孢子耐受高温的能力有限,但土壤中的孢子凭借泥炭的良好热缓冲性,可以躲避火烧高温造成的致命伤害,适度的热激甚至能提高其萌发力,对其在火后的建植及种群的长存可能有重要意义.     

甘肃金水湖国家湿地公园景观自然性的时空异质性

景观自然性体现了各景观要素的时空分布格局,对提高生态系统的整体性和稳定性有重要意义.通过解译2003年、2009年和2015年3个时相的遥感影像,利用GIS和层次分析法,研究了甘肃金川金水湖国家湿地公园景观自然性变化规律.结果表明:随着时间的变化,景观结构中景观多样性指数、均匀度指数、斑块丰富度呈增加趋势,景观优势度、景观分离度呈减小趋势;提供栖息地、植物群落维持功能、面积加权平均斑块分维数、植被覆盖度等生态功能指标呈增大趋势;人工干扰指数、人工景观平均面积等生态学干扰指标呈减小趋势,湿地公园的景观自然性指数由2003年的0.4761增加至2015年的0.7485.湿地公园保育和恢复工程的实施改变了土地覆被结构,增强了生态系统的稳定性、生态弹性和服务价值,较大程度上提高了金水湖国家湿地公园的景观自然性.     

RNAi靶向VP2基因抑制中蜂囊状幼虫病毒在中华蜜蜂幼虫体内复制研究

中蜂囊状幼虫病(Chinese sacbrood disease,CSBD)是造成中华蜜蜂患病死亡的主要原因之一,目前尚无有效的治疗方法。为了研究靶向中蜂囊状幼虫病毒(Chinese sacbrood virus,CSBV)结构蛋白VP2基因的siRNA介导的RNA干扰(RNA interference,RNAi)作用和其对CSBV在中华蜜蜂幼虫体内复制的影响,设计合成针对CSBV VP2基因的特异性siRNA,以100 nM的浓度与pEGFPN1-VP2-CSBV融合表达载体共同转染至293T细胞中,通过荧光显微镜和流式细胞仪观察和分析siRNA在体外对CSBV VP2基因表达的干扰效果。同时,将siRNA(1μg/μL)和1×10~7拷贝数的CSBV共同饲喂2日龄中华蜜蜂幼虫,检测幼虫体内CSBV拷贝数和幼虫存活率,研究siR-NA对中华蜜蜂幼虫体内CSBV复制的影响。荧光结果显示,在293T细胞中siRNA能抑制CSBV VP2蛋白的表达,并且通过流式细胞仪检测分析发现干扰效果接近40%。幼虫饲喂实验表明,饲喂siRNA组在各时间点幼虫体内CSBV拷贝数均低于CSBV对照组,且在摄入siRNA后感染CSBV的幼虫存活率明显上升,与CSBV组差异极显著(P<0.01)。通过本研究,证明了针对CSBV结构蛋白VP2基因的特异性siRNA能够介导产生RNAi,影响CSBV在中蜂体内的复制,为深入研究CSBV VP2基因的功能和研发抗CSBV生物制剂提供了理论基础。     

蚁巢受到干扰后红火蚁工蚁的连续性活动变化

红火蚁Solenopsis invicta Buren工蚁活动能力与蚁群健康、环境条件等密切相关,对蚁群进行干扰会引起工蚁防卫和攻击行为。本文采用标尺插入法对蚁巢进行干扰破坏,测定了工蚁活动性指数,结果显示在相同干扰程度下活动性指数随蚁巢体积增大而增大,相同蚁巢时随着干扰程度增加而活动性指数先迅速增大后基本保持不变。间隔5 min对蚁巢实施连续干扰后工蚁活动性呈明显连续下降趋势,第5次干扰后工蚁的响应活动变得很弱,工蚁活动性指数与干扰时间之间关系符合二次曲线方程。     

大鼠Otos基因RNA干扰质粒体的构建

目的:构建其基因Otos的RNA干扰质粒载体,为研究Otospiralin在内耳的生理功能奠定基础。方法:在GenBank中查到大鼠Otos基因的序列,输入到相应的设计软件中,以此设计引物序列,经过PCR扩增,酶切后,克隆于pAVU6 27载体并行酶切鉴定。结果:构建的鼠Otos shRNA载体经过测序鉴定,所得和预期相符。结论:重组质粒pAVU6 27-Otos的成功构建为下一步研究打下良好的基础。