三角帆蚌细胞色素P450基因的克隆与表达分析

CYP是一类以血红素为辅基的末端加氧酶,广泛存在于人、动物、植物和微生物之中,参与许多外源性物质(药物、毒物和环境污染物质等)和内源性物质(激素、脂肪酸等)的代谢,在碳源同化、激素合成、外源物质降解和致癌物质消除等方面发挥重要作用,亦对维持生物体     

珍稀植物杨叶肖槿ISSR体系建立及检测

针对珍稀植物杨叶肖槿ISSR反应的特点,建立了适用于杨叶肖槿遗传多样性研究的ISSR最适反应体系,具体包括:2.0μL 10×Buffer,27.5ng的模板DNA,2.0μL的dNTP,1U的Pyrobest DNA酶,1.25μmol/L的引物;最佳反应程序为94℃预变性5min,然后94℃变性1min,49℃退火45s,72℃延伸1min,35个循环;最后72℃延伸10min,4℃终止反应。应用该优化的反应体系筛选出了10条稳定性强、清晰度高而且表现出一定多态性的ISSR引物,并对杨叶肖槿进行了检测,获得了清晰稳定的扩增图谱。     

盐芥miRNAs耐盐表达研究

以盐生植物盐芥为实验材料,选择经过Solexa测序筛选的盐芥tsa-miR172a和tsa-miR398b为目标基因,采用茎环的反转录PCR(stem-loop RT-PCR)方法分析其在盐芥根中的耐盐表达模式,以探讨盐芥miRNAs的stem-loop RT-PCR验证体系。结果显示,经过300mmol.L-1 NaCl处理72h后,与对照相比,盐芥根中的tsa-miR172a上调表达,tsa-miR398b下调表达。用stem-loop RT-PCR方法进行tsa-miR172a和tsa-miR398b扩增,对其电泳图进行光密度分析结果显示,盐胁迫处理与对照的比值分别为1.8和0.55,Solexa测序结果分别为2.00和0.44,说明两种方法所得结果基本一致。表明该研究建立了盐芥miRNAs的stem-loop RT-PCR验证体系:每个miRNA设计3个引物(miRNA stem-loop引物、miRNA正向引物和miRNA通用反向引物);扩增条件为94℃2min,94℃15s,55℃45s,23个循环。     

香蕉MaCAM基因克隆及表达分析

从香蕉根的cDNA文库中获得了一段香蕉钙调蛋白基因的片段,采用RACE技术获得其全长,命名为MaCAM。该基因全长845bp,编码149个氨基酸。生物信息学分析表明,该蛋白属稳定蛋白,其等电点为4.12,有2个保守的EFh功能结构域。与已知植物的钙调蛋白基因相比,一致性达90%以上。其中与粳稻、油棕、胡萝卜、甘蔗的CAM编码的氨基酸序列的一致性分别为99.33%、96.71%、98.00%、98.66%。系统进化树比对分析显示,香蕉与甘蔗的亲缘关系最为密切。器官特异性分析表明,MaCAM在香蕉的根、球茎、叶片、花和果实中均有所表达,在根中表达量最高,花中次之,而在叶片中的表达量最低。     

香蕉苹果酸脱氢酶基因克隆及其逆境胁迫表达

从香蕉果实抑制差减文库中获得一条香蕉苹果酸脱氢酶基因片段,采用RACE技术获得全长,命名为MaMDH;MaMDH基因全长1 249bp,编码332个氨基酸。生物信息学分析预测其编码蛋白分子量约35 448Da,等电点为6.53。与已知植物苹果酸脱氢酶基因相比,氨基酸同源性均达92%。保守结构域分析发现,MaMDH基因具有NAD结合位点、苹果酸结合位点和二聚体结合位点。系统进化树比对分析表明,MaMDH与玉米和小麦的亲缘关系较近。MaMDH基因在乙烯利处理香蕉苗中上调表达;在盐、Al 3+胁迫和香蕉尖孢镰刀菌4号生理小种处理幼苗中先上调表达,后下调表达;在冷害胁迫幼苗中先下调表达,后上调表达;而在干旱胁迫、伤害胁迫幼苗中表达没有明显变化。研究表明,香蕉中的苹果酸脱氢酶基因具有响应生物胁迫和非生物胁迫能力,可能在香蕉适应衰老、盐、铝、低温胁迫和枯萎病菌侵染等逆境中发挥重要作用。     

龙眼生长素应答因子基因克隆及其在体胚中的表达分析

以龙眼胚性愈伤组织为材料,采用RT-PCR结合RACE法克隆生长素应答因子基因(auxin response fac-tor,即DL-ARF1),运用生物信息学方法对序列进行分析,并通过实时荧光定量PCR法研究其在龙眼体细胞胚胎发生过程中的表达。结果表明:DL-ARF1基因的mRNA全长序列为2 695bp(GenBank登录号GQ923778),包含2 046bp开放阅读框,163bp 5′非编码区(5′UTR),486bp 3′非编码区(3′UTR);推定的氨基酸序列含681个氨基酸,与其它植物ARF基因相似性达40%～81%。DL-ARF1基因可能属于转录抑制因子,在龙眼体胚的各阶段均有表达,整个变化趋势呈双峰形,在胚性愈伤Ⅱ(Stage 2)中的表达量最高。     

预约挂号平台出票客户端的设计与应用

目的 为预约挂号患者提供出票服务,分流挂号窗口排队人群。方法 设计预约挂号出票客户端,自助服务与人工服务相结合,合理规划业务流程。结果 预约挂号患者不需在挂号窗口排队,可为预约挂号患者提供24小时多地点自助出票服务,同时实现医院对预约挂号第三方支付的财务监管。结论 预约挂号出票客户端极大地方便了患者及医院,具有较好的可行性。     

Tbx18-Cre基因敲入小鼠的繁殖、鉴定及其应用

为了探讨Tbx18-Cre基因敲入小鼠(Tbx18:Cre knock-in Mus musculus)的繁殖、鉴定及Tbx18基因敲除小鼠和遗传示踪小鼠模型的应用,将Tbx18-Cre基因敲入杂合子小鼠进行繁殖,应用PCR法鉴定其子代基因型。将子代雌雄杂合子小鼠互交,应用H.E染色观察Tbx18基因敲除胚鼠心的形态学变化。将杂合子小鼠与RosaEYFP报告小鼠交配,应用心冰冻切片技术观察Tbx18:Cre/Rosa26REYFP双转基因遗传示踪胚鼠心内Tbx18阳性心外膜祖细胞发育命运。结果表明,用于繁殖、基因敲除研究及基因遗传示踪的子代基因型均符合孟德尔遗传规律。同时心H.E染色和心冰冻切片发现,Tbx18敲除小鼠心窦房结发育存在缺陷,而Tbx18阳性心外膜祖细胞是心发育重要的祖细胞来源。研究结果揭示,Tbx18-Cre基因敲除小鼠是研究先天性心脏病发病机制的理想模式动物,Tbx18阳性心外膜祖细胞可能是心脏病患者心脏修复和再生潜在的种子细胞。     

鳜两种生长抑素受体cDNA全长克隆与组织表达

利用cDNA末端快速扩增(RACE)技术克隆了鳜(Siniperca chuatsi)脑中2种生长抑素受体(somatostatin receptor,SSTR2和SSTR3)cDNA全长序列。结果显示,鳜SSTR2 cDNA全长1 820 bp,含开放阅读框1 146 bp,编码382个氨基酸;SSTR3 cDNA全长1 874 bp,含开放阅读框1 458 bp,编码486个氨基酸。SSTR均由5个结构区域组成:N端、7个转膜区(TMD)、3个细胞外袢(ECLs)、4个细胞内袢(ICLs)和C末端。NJ系统进化树分析显示,鳜SSTR2和SSTR3分别形成相对独立的分支,两者间的氨基酸序列相似度为51.2%,表明它们是由不同基因编码而成。利用实时荧光定量RT-PCR技术检测了鳜SSTR2和SSTR3 mRNA的组织表达特征,它们均在多种组织中广泛表达,SSTR2 mRNA在肝中表达量最高,SSTR3 mRNA在胃中表达量最高。SSTR2、SSTR3表达差异反映它们可能参与不同生理调控作用。     

杨柳田头菇B交配型基因信息素受体片段的克隆与分析

利用简并PCR及DNA步移法,从杨柳田头菇Agrocybe salicacola YAASM0711菌株中扩增得到了一个4 231 bp的核酸片段.经过比对及序列预测,所获得序列中含有杨柳田头菇交配型编码基因中的信息素受体部分,其序列长度为1194 bp,包含4个内含子,5个外显子的长度分别为217 bp,113 bp,67 bp,138bp,449 bp.拼接后的ORF全长984 bp,编码327个氨基酸残基.该序列与灰盖鬼伞Coprinus cinerea、双色蜡蘑Laccaria bicolor信息素受体氨基酸序列较为相似,含有7个跨膜区.信息素受体遗传进化分析显示,其与多个物种信息素受体聚集在一起,可能与真菌信息素受体的多种起源有关.