粉尘螨线粒体样苹果酸脱氢酶基因cDNA克隆和分子特征分析

摘要 目的：获取粉尘螨线粒体样苹果酸脱氢酶蛋白（mitochondrial-like malate dehydrogenase，mMDH）的编码基因并了解其分子特征。方法：以粉尘螨Total RNA为模板，RT-PCR扩增获得mMDH编码基因后、构建原核表达质粒，转化E.coil BL21(DE3)感受态细胞中，IPTG诱导表达，SDS-PAGE和Western Blot鉴定目的蛋白表达情况。采用NCBI、EXPASY在线生物信息学软件分析该基因编码蛋白质的生物学特征。结果：获得粉尘螨线粒体样苹果酸脱氢酶蛋白的编码基因，全长1032bp。构建的原核表达质粒pET28a(+)-mMDH，经转化和诱导表达后，SDS-PAGE和Western Blot可见目的蛋白条带。该基因编码的蛋白质由343个氨基酸组成，相对分子质量（Mr）36014.54Da，亚细胞定位主要在细胞质和细胞核，含有34个磷酸化位点（19个丝氨酸，12个苏氨酸和3个酪氨酸）。糖基化预测结果显示其含有2个N-糖基化位点（123位存在糖基化位点NASI和151位存在糖基化位点NSTV）和1个0-糖基化位点。二级结构主要为?琢-螺旋和无规则卷曲。三维建模可观察到该蛋白为二聚体结构，CD-Search保守区域分析后显示其属于NADB-Rossmann家族，具有MDH-glyoxysomal-mitochondrial结构域。PyMol可视化后可在三维结构中观察到保守区域位点。将该基因推导出的氨基酸序列进行Blast获得同源基因，粉尘螨与屋尘螨、梅氏嗜霉螨进化关系较近，独成一簇。结论：获得粉尘螨线粒体样苹果酸脱氢酶蛋白的编码基因全长及其原核表达质粒，并对其生物学特征进行分析，为进一步探讨该基因的生理功能、开发尘螨控制措施奠定基础。     

香蕉钙调蛋白基因MaCAM在非生物胁迫下的表达分析

为研究香蕉钙调蛋白基因MaCAM的功能,对香蕉幼苗进行盐、低温和干旱胁迫处理,利用荧光定量PCR技术分析香蕉根中钙调蛋白基因MaCAM在上述不同非生物胁迫条件下的表达特性.盐胁迫处理后MaCAM表达随时间延长为先增加后降低趋势,在处理4 h时表达量最高;低温胁迫处理后,MaCAM的表达量随温度降低呈梯度增加,在温度降至5℃时表达量在处理范围内达最大值;干旱胁迫处理后,MaCAM的表达量随胁迫程度增加也是呈梯度增加,重度干旱胁迫时在处理范围内表达量最高.说明香蕉中的钙调蛋白基因具有响应非生物胁迫的能力,可能在香蕉适应盐、低温和干旱等胁迫逆境中发挥重要作用,参与了香蕉幼苗抗逆性调控.     

厚藤ASR基因克隆及功能初步分析

通过对厚藤(Ipomoea pes-caprae(Linn.)Sweet.)cDNA文库的筛选,获得了一个编码厚藤ASR(ABA-stress-ripening)基因的全长cDNA,命名为IpASR。研究结果显示,IpASR编码区全长648 bp,共编码215个氨基酸;蛋白质等电点为5.42,分子量为24.57 k D。通过在酵母中表达,发现IpASR能够提高转基因酵母的耐盐性及抗氧化能力。进一步以厚藤成年植株及幼苗为材料进行实时荧光定量PCR分析,结果表明,IpASR基因在厚藤成年植株各组织中广泛表达;高盐、甘露醇胁迫和ABA处理可诱导该基因在厚藤幼苗中的表达。结合GFP融合蛋白的亚细胞定位和生物信息学分析,发现IpASR蛋白为核蛋白,推测IpASR基因参与了厚藤生长发育的调控,并可响应ABA和非生物胁迫的诱导。     

玉米苹果酸脱氢酶基因的分离与结构分析

以一个玉米（ＺｅａｍａｙｓＬ．）杂种一代超亲表达的ｃＤＮＡ片段为探针,从玉米幼苗期ｃＤＮＡ文库中筛选到一个全长１２８７ｂｐ的ｃＤＮＡ克隆。序列分析表明,该ｃＤＮＡ编码细胞质苹果酸脱氢酶,推导的氨基酸序列与龙须海棠（Ｍｅｓｅｍｂｒｙａｎｔｈｅｍｕｍ　ｃｒｙｓｔａｌｌｉｕｍ　Ｌ．）及拟南芥（Ａｒａｂｉｄｏｐｓｉｓ　ｔｈａｌｉａｎａ（Ｌ．）Ｈｅｙｎｈ．）同一编码基因的氨基酸序列同源性分别为９０％和８４％。这是禾谷类作物中首次克隆的编码细胞质苹果酸脱氢酶的完整基因。     

小麦TaLEC1基因的克隆及其表达特性分析

为了探讨LEC1基因在小麦(Triticum aestivum L)非生物胁迫应答中的功能,该研究通过RT-PCR结合RACE技术克隆小麦TaLEC1基因,并采用qRT-PCR方法分析了该基因在小麦不同组织以及不同处理下的表达模式,为深入研究小麦LEC1基因在干旱、高温和高盐胁迫下的响应机制奠定基础。结果表明:(1)成功克隆到小麦TaLEC1基因,该基因cDNA序列全长为1 074 bp,其中5′端非编码区23 bp,开放阅读框为741 bp,3′端非编码区310 bp,编码246个氨基酸,具有典型的CBFD_NFYB结构域。(2)实时荧光定量分析显示,TaLEC1在不同组织间表达差异显著,10 d龄幼苗的叶中表达量最高。(3)TaLEC1基因可被植物激素ABA诱导而上调表达,属于ABA依赖型的表达调控通路。(4)PEG模拟干旱胁迫处理后的0.5～1 h,TaLEC1基因呈上调表达;42℃胁迫处理过程中,TaLEC1基因呈稳定上调表达趋势,并在胁迫处理后12 h和48 h时表达急剧上调,分别为对照的52.8倍和34.5倍;NaCl胁迫处理0.5 h时TaLEC1基因迅速上调表达。研究表明,小麦TaLEC1基因参与ABA依赖的胁迫响应,推测可能在小麦耐受高温胁迫和渗透胁迫过程中发挥着重要的脱水保护功能。     

玉米逆境胁迫响应基因ZmbZIP71的克隆与表达分析

从玉米抗旱自交系CN165中克隆得到了与逆境胁迫相关的bZIP（Basic Leucine Zipper Protein）基因ZmbZIP71。ZmbZIP71基因的开放阅读框为471 bp,编码156个氨基酸,相对分子量为17.59 kDa,等电点pI为9.24。ZmbZIP71蛋白包含真核生物中高度保守的bZIP结构域。ZmbZIP71基因编码区的基因组序列全长为1050 bp,包括2个外显子和1个内含子。利用实时荧光定量PCR方法分析ZmbZIP71基因在玉米不同组织中的表达差异及其在非生物胁迫下的表达模式,结果表明,该基因在雄穗和雌穗中的表达量较高,并且受干旱、低温和ABA的胁迫诱导上调表达,在盐胁迫下下调表达。     

香蕉MaTPS1基因序列及其表达特性分析

通过随机克隆测序法,从香蕉根系cDNA文库中获得海藻糖合成酶基因,命名为MaTPS1。MaTPS1扩增获得cDNA序列,全长3 946bp,开放阅读框2 562bp,编码853个氨基酸。生物学信息分析表明,MaTPS1蛋白属于不稳定蛋白,等电点4.72,具有TPS和TPP结构域。序列预测分析表明,MaTPS1蛋白定位于细胞质中,不存在信号肽,为跨膜疏水蛋白。与已知植物TPS氨基酸同源序列比对结果显示,一致性达74.81%,其中与2种马来西亚野生蕉、玉米、野茶树、中果咖啡的TPS编码氨基酸序列一致性分别为100%、79.91%、71.33%、63.93%和65.13%。器官特异性分析表明,MaTPS1在香蕉的根、球茎、假茎、叶、花和果实中都有表达,其中在根、球茎、假茎和花中表达量较高。qRT-PCR分析表明,ABA、ACC、干旱、低温、盐害和枯萎病胁迫处理后,MaTPS1表达量在盐胁下增加,于24h时达到最高,而在其他胁迫下较正常条件下降低。研究认为,MaTPS1可能参与调控香蕉抗盐胁迫机制,从而提高香蕉耐盐性。     

一个深黄被孢霉苹果酸脱氢酶基因的克隆与表达

根据转录组测序结果设计特异性引物,以深黄被孢霉(Mortierella isabellina)M6-22的c DNA为模板,PCR扩增苹果酸脱氢酶基因MIMDH2,测序结果显示该序列长1 017 bp,编码338个氨基酸。序列分析表明该序列与已报道的烟曲霉(Aspergillus fumigates)线粒体苹果酸脱氢酶的相似性最高,达71.26%,且含有苹果酸脱氢酶的保守辅酶结合位点、底物结合位点和催化活性位点。将MIMDH2片段连接到表达载体pET32a(+)中,构建重组表达质粒pET32a-MIMDH2,并转化至大肠杆菌BL21中进行诱导表达,SDS-PAGE电泳检测结果显示在50 k D左右处有一蛋白质条带,酶活分析结果显示经镍柱亲和层析纯化的重组蛋白酶活高达271.33 U/mg。以上结果说明所克隆的MIMDH2为一个新的潜在的苹果酸脱氢酶基因,所编码的蛋白质具有苹果酸脱氢酶的活性。     

刺芹侧耳不同发育时期的转录组差异分析

为了探讨刺芹侧耳子实体生长发育时期的基因表达变化,本文利用高通量测序技术对刺芹侧耳不同发育时期（菌丝期、原基期、子实体时期）进行RNA-Seq分析,在转录水平上解析差异表达基因在刺芹侧耳生长发育过程中的作用和功能。KEGG功能富集显示,菌丝期差异表达基因主要富集在碳代谢和氨基酸代谢中,其中三羧酸循环中编码柠檬酸合酶、乌头酸水合酶、异柠檬酸脱氢酶、琥珀酰辅酶A合成酶、琥珀酸脱氢酶、苹果酸脱氢酶的基因表达量均上调,说明碳代谢和氨基酸代谢是菌丝时期的主要能量来源;原基期上调的差异表达基因主要富集在脂肪酸代谢,其中RT-PCR定量结果显示原基期编码脂肪酸合酶的基因和编码脂酰辅酶A合成酶的基因下调,编码超氧化物酶的基因和编码过氧化氢酶的基因上调,表明脂肪酸代谢和抗氧化酶对刺芹侧耳原基期维持机体的稳定和生物应激方面起着重要作用。子实体时期上调的差异表达基因主要富集在剪接体、类固醇的生物合成以及AMPK信号通路中,说明环境因子对子实体时期有一定的影响。     

外源亚精胺对盐胁迫下黄瓜幼苗游离态多胺含量和多胺合成酶基因表达的影响

以黄瓜品种‘津春2号’（Cucumis sativusL.cv.Jinchun No.2）为材料,采用营养液栽培,研究了外源亚精胺（Spd）对NaCl胁迫下黄瓜幼苗叶片游离态多胺含量和多胺合成酶基因表达的影响。结果表明,75 mmol/LNaCl胁迫下,幼苗株高、茎粗和干鲜重显著降低,外源喷施1 mmol/L Spd处理可明显缓解盐胁迫对幼苗生长的抑制。盐胁迫下叶片游离态多胺含量显著增加,外源Spd进一步促进了游离态Spd和精胺（Spm）的积累,降低了游离态腐胺（Put）的积累。多胺合成酶基因表达分析表明,盐胁迫上调了adc、odc、samdc和spds基因的表达,施用外源Spd后进一步上调了samdc基因,下调了adc、odc、spds基因的表达。表明外源Spd参与了黄瓜幼苗体内多胺代谢的调节,通过下调盐胁迫下adc、odc基因的表达,抑制游离态Put的积累,上调samdc基因的表达促进游离态Spd和Spm的积累,进而缓解盐胁迫对植物生长的抑制。     

Expression of a single gene encoding microbody NAD-malate dehydrogenase during glyoxysome and peroxisome development in cucumber

A full-length cDNA clone encoding microbody NAD⁺-dependent malate dehydrogenase (MDH) of cucumber has been isolated. The deduced amino acid sequence is 97% identical to glyoxysomal MDH (gMDH) of watermelon, including the amino terminal putative transit peptide. The cucumber genome contains only a single copy of this gene. Expression of this mdh gene increases dramatically in cotyledons during the few days immediately following seed imbibition, in parallel with genes encoding isocitrate lyase (ICL) and malate synthase (MS), two glyoxylate cycle enzymes. The level of MDH, ICL and MS mRNAs then declines, but then MDH mRNA increases again together with that of peroxisomal NAD⁺-dependent hydroxypyruvate reductase (HPR). The mdh gene is also expressed during cotyledon senescence, together with hpr, icl and ms genes. These results indicate that a single gene encodes MDH which functions in both glyoxysomes and peroxisomes. In contrast to icl and ms genes, expression of the mdh gene is not activated by incubating detached green cotyledons in the dark, nor is it affected by exogenous sucrose in the incubation medium. The function of this microbody MDH and the regulation of its synthesis are discussed.     

Cloning, sequencing and functional expression of cytosolic malate dehydrogenase from Taenia solium: Purification and characterization of the recombinant enzyme

We report herein the complete coding sequence of a Taenia solium cytosolic malate dehydrogenase (TscMDH). The cDNA fragment, identified from the T. solium genome project database, encodes a protein of 332 amino acid residues with an estimated molecular weight of 36517 Da. For recombinant expression, the full length coding sequence was cloned into pET23a. After successful expression and enzyme purification, isoelectrofocusing gel electrophoresis allowed to confirm the calculated pI value at 8.1, as deduced from the amino acid sequence. The recombinant protein (r-TscMDH) showed MDH activity of 409 U/mg in the reduction of oxaloacetate, with neither lactate dehydrogenase activity nor NADPH selectivity. Optimum pH for enzyme activity was 7.6 for oxaloacetate reduction and 9.6 for malate oxidation. K_cat values for oxaloacetate, malate, NAD, and NADH were 665, 47, 385, and 962 s⁻¹, respectively. Additionally, a partial characterization of TsMDH gene structure after analysis of a 1.56 Kb genomic contig assembly is also reported.     

矮化香蕉及其野生型GA3ox基因的结构特点和表达分析

香蕉的矮化突变是香蕉无性繁殖后代最常见的表型变异之一,但其变异的分子调控机理目前尚未研究清楚; 而内源赤霉素是影响植物株高的重要激素之一,GA3-氧化酶是赤霉素生物合成后期的关键酶。为探究GA3-氧化酶编码基因对香蕉矮化的分子调控机理,该研究以威廉斯B6矮化突变体及其野生型亲本为材料,通过RT-PCR技术克隆得到矮化香蕉及其野生型亲本GA3ox基因的全长cDNA序列,并对其推测的氨基酸序列进行比对分析,同时利用qRT-PCR技术对GA3ox基因在不同组织中的表达水平差异进行分析。结果表明:(1)矮化香蕉GA3ox-A和野生型香蕉GA3ox-G的ORF长度均为864 bp,均编码287个氨基酸,经序列比对分析发现两条氨基酸序列之间存在5个位点的差异,从而产生具有不同性质的蛋白质。(2)氨基酸序列同源性分析表明,矮化香蕉GA3ox的氨基酸序列与油棕、海枣、椰子的同源性最高。(3)qRT-PCR显示,GA3ox基因在矮化香蕉叶片和茎秆中的表达水平整体上低于野生型,其中GA3ox在野生型茎秆中的表达水平是矮化植株的2.2～32倍。综上推测,GA3ox基因可能对香蕉茎杆的矮化变异具有重要的调控作用。该研究结果为揭示香蕉矮化突变的分子机制与筛选优良矮化香蕉株系奠定了基础。     

香蕉胁迫相关蛋白基因的克隆及其表达分析

通过随机克隆测序的方法从香蕉根系cDNA文库中获得胁迫相关蛋白基因,命名为MaSAP1(GenBank登录号为AGH14257.1)。扩增获得的cDNA序列与质粒OZ092的目的片段序列一致,表明MaSAP1是香蕉SAP基因编码框全长cDNA,包含一个510bp的最大开放阅读框,编码一个长169个氨基酸的蛋白质。蛋白质序列同源比对发现其含有完整的A20和AN1基序结构。系统进化树比对分析表明,MaSAP1与水稻和獐茅的亲缘关系较近。组织特异性研究表明,MaSAP1基因在香蕉根和果实中的表达量较高,在茎中的表达量最低。实时荧光定量PCR分析表明MaSAP1响应激素的处理,同时也响应干旱、低温、高盐和枯萎病菌的侵染等胁迫。可见,MaSAP1基因在植物生长发育和植物响应逆境中具有重要作用。     

阜豆GmABC基因的克隆及表达分析

利用RACE技术从大豆品种‘阜豆11号’中克隆到1个ABC转运蛋白基因,该基因cDNA全长为4 693bp,其中开放读码框4 341bp,编码1 447个氨基酸,分子量162.5kD,具有高度保守的ATP结合位点,命名为GmABC。蛋白序列比对结果显示,该基因编码蛋白属于PDR(pleiotropic drug resistance)多向耐药性蛋白家族成员。系统进化树分析显示,GmABC与苜蓿PDR亲缘关系最近,相似性达84%。基因表达分析显示,GmABC受镉诱导表达,当Cd2+浓度达到100mg.L-1时,其表达量最高。研究表明,GmABC可能对阜豆镉胁迫抗性发挥重要作用。