狂犬病疫苗蔗糖密度梯度离心纯化工艺开发

目的:开发冻干人用狂犬病疫苗(鸡胚成纤维细胞)的连续流蔗糖密度梯度离心纯化工艺。方法:分别比较两种不同初始蔗糖浓度和不同上样速度对纯化效果的影响,初步确定纯化工艺;通过多批次实验确定样品收集范围;比较不同浓缩倍数条件下杂质去除和抗原回收情况,确定合适的收获液浓缩比例;比较不同批次样品纯化后的杂质去除率和重复性,判定本纯化工艺的稳定性。结果:选取60%作为初始蔗糖浓度,在上样速度为150～200ml/min时,可以有效地对10倍浓缩的病毒收获液进行纯化;卵清蛋白、牛血清白蛋白和庆大霉素去除率分别达到99%,95%和95%,且工艺具有极好的稳定性。结论:开发的连续流蔗糖密度梯度离心技术可以作为冻干人用狂犬病疫苗(鸡胚成纤维细胞)的产业化纯化工艺。     

免疫佐剂在肿瘤免疫疗法中的应用进展 *

免疫疗法是预防和治疗疾病的有效手段之一.近年来,肿瘤免疫疗法已成为一种新型治疗方法,相关肿瘤疫苗已在多种肿瘤的治疗中被证明有效.然而,在肿瘤疫苗的设计中,肿瘤抗原免疫原性弱,应答率低等问题是目前面对的一大挑战,佐剂的加入为问题的解决提供了一种新的方法和思路.免疫佐剂在提高肿瘤抗原免疫原性,激活机体适应性免疫应答等方面起着十分重要的作用.为了解近几年免疫佐剂的发展及其研究现状,针对目前常用的抗肿瘤佐剂进行综述,并总结了其对免疫系统的作用机制,为后续的疫苗设计策略提供帮助.     

全球冠状病毒疫苗专利分析

冠状病毒是一类可感染人类和动物的RNA病毒,可引起严重急性呼吸综合征(SARS)和中东呼吸综合征(MERS)等严重疾病。新型冠状病毒是以前从未在人体中发现的冠状病毒新毒株,其人际传播迅速,引起了各国政府的高度重视并积极寻求疫苗防控对策。基于冠状病毒疫苗领域全景专利,在综合对比分析该领域的全部专利的发展趋势、主要国家和主要机构的专利产出的同时,重点揭示了其中的人用相关疫苗的发展与分布情况以及重点分析了人用疫苗产品的研发现状,以期为我国冠状病毒疫苗领域的科研工作者和管理决策者提供参考数据。     

糖芯片技术在肿瘤研究中的应用

糖基化修饰是蛋白质常见的翻译后修饰之一,通过与糖结合蛋白如凝集素、抗体等相互作用调节肿瘤细胞侵袭、转移的能力及肿瘤异质性。通过化学合成法、化学-酶合成法或释放天然聚糖构建的糖芯片是分析聚糖与糖结合蛋白相互作用的重要工具。文中综述了常见的点制糖芯片的技术及糖芯片在癌症疫苗、单克隆抗体及诊断标志物中的广泛运用。由于肿瘤发生的各个环节都伴随着聚糖结构的改变,利用糖芯片探究肿瘤细胞特异表达的聚糖所参与的生理病理过程具有重大意义。     

口蹄疫病毒非结构蛋白3AB双抗体夹心ELISA方法的建立

抗原纯净度是口蹄疫 (Foot-and-mouth disease,FMD) 灭活疫苗质量检验的一项重要内容,一般采用疫苗2–3次免疫动物后,检测非结构蛋白 (Non-structural protein,NSP) 抗体是否阳转,判断疫苗抗原的纯净度。文中旨在建立定量检测FMD灭活疫苗抗原中NSP 3AB含量的ELISA方法,为疫苗质量控制提供参考方法。利用口蹄疫病毒 (Foot-and-mouth disease virus,FMDV) NSP 3A单克隆抗体和辣根过氧化物酶 (Horseradish peroxidase,HRP) 标记的3B单克隆抗体,建立定量检测NSP 3AB含量的双抗体夹心ELISA检测方法。采用原核表达并纯化的3AB蛋白作为标准品,标准品系列稀释,绘制标准曲线,以标准品与未加抗原的阴性对照吸光值 (OD) 的比值大于2.0的标准品最低浓度为最低检测限。标准品浓度介于4.7–600.0 ng/mL之间时,测得的OD值与浓度呈线性相关,回归曲线呈直线,相关系数R2=0.99,确定最低检测限为4.7 ng/mL。检测12份未纯化灭活抗原中3AB蛋白含量介于9.3–200.0 ng/mL之间;而纯化后的病毒抗原中3AB蛋白残留量低于最低检测限;33份来自不同厂家的成品疫苗抗原中9份疫苗抗原3AB蛋白含量在9.0–74.0 ng/mL之间,其余24份疫苗抗原中3AB蛋白残留量低于最低检测限。检测3AB蛋白含量的双抗体夹心ELISA方法能够特异、敏感地检测疫苗抗原中的3AB蛋白含量,为疫苗质量控制与纯净度检验提供了一种可供选择的检测方法。     

不同功能基团对3型肺炎球菌荚膜多糖免疫原性影响的初步研究

目的比较3型肺炎链球菌荚膜多糖不同基团活化对多糖抗原性及结合物免疫原性的影响。方法分别采用1-氰基-4-二甲氨基-吡啶四氟硼酸(1-cyano-4-dimethylaminopyridinium tetrafluoroborate, CDAP)活化多糖羟基,碳二亚胺(1-(3-dimethylaminopropyl)-3-ethylcarbodiimide hydrochloride, EDC)活化多糖羧基,再与己二酰肼(adipic dihydrazide, ADH)偶联获得活化度相近的多糖衍生物。用三硝基苯磺酸方法(trinitrobenzene sulfonic acid, TNBS)测定多糖活化度;高效液相分子排阻与多角度激光散射仪联用(HPLC-SEC-MALLS)分析衍生物分子分布和大小;Zeta电位仪与滴定仪联用分析其表面电荷变化;速率比浊法和免疫双扩散法比较其抗原性变化;利用多糖衍生物与载体蛋白偶联获得的不同结合物免疫小鼠,间接ELISA分析不同结合物免疫后的IgG抗体浓度,进一步阐述活化过程中多糖抗原性的变化对结合物免疫原性的影响。结果 TNBS结果显示,获得同一基团不同活化度(5%～30%)、不同基团(羟基和羧基)活化度相近的多糖衍生物;等电点分析结果显示,不同基团的活化会导致多糖表面不同的电荷变化;而速率比浊和免疫双扩散的结果显示,多糖羟基的活化会导致多糖抗原性略有下降,但不同活化度之间差异较小;在相似活化度情况下,羧基衍化物的抗原性更低,随着羧基活化度的增加,多糖抗原性下降明显(约60%)。小鼠ELISA结果显示,对羧基不同程度活化得到的结合物,其免疫原性较多糖明显提高,差异具有统计学意义(P<0.05);随着多糖羧基活化度的增加,结合物免疫原性先增加后降低。结论 3型多糖重复单位上的羧基的改变对抗原性影响较羟基更大,对羧基的过度活化会影响结合物的免疫原性。     

人乳头瘤病毒疫苗对宫颈以外部位肿瘤的保护效果研究

人乳头瘤病毒(human papillomavirus,HPV)感染可导致肛门-生殖器及口咽等多部位肿瘤.近年来,随着对HPV研究的深入及多种HPV疫苗陆续上市,HPV疫苗对于多部位肿瘤的保护效果受到越来越多的关注.已有大量研究证明HPV疫苗能够有效预防宫颈癌的发生,而近年也逐渐积累了一些HPV疫苗预防宫颈以外部位肿瘤的证据.本文拟综述HPV疫苗对于头颈、肛门、外阴与阴道、阴茎部位肿瘤保护效果的研究进展.     

鉴别检测非洲猪瘟野毒株和基因缺失疫苗株的三重荧光PCR的建立

非洲猪瘟是由非洲猪瘟病毒(African swine fever,ASFV)引起的猪的一种急性、高度接触性传染病.本研究根据ASFV B646L、MGF360-14L和CD2v基因设计了 3套引物和探针,建立了可同时鉴别检测ASFV野毒株和基因缺失疫苗株的三重荧光PCR方法.结果表明,该法特异性强,可同时检测ASFV B646L、MGF360-14L和CD2v基因,与猪圆环病毒2型、猪瘟病毒、猪繁殖与呼吸综合征病毒、口蹄疫病毒、猪A型塞内卡病毒等无交叉反应;两份ASFV MGF360-505R与CD2v基因联合缺失疫苗株DNA三重荧光PCR法检测结果都仅出现一条B646L扩增曲线,与预期一致;灵敏度高,该法对重组质粒pUC-B646L、pUC-360-14L和pUC-CD2v的检出限分别为1.572×103拷贝/mL、1.934×103拷贝/mL 和 1.929×103拷贝/mL,灵敏度比世界动物卫生组织(World organization for animal health,OIE)推荐的荧光PCR高10倍;重复性好,对三种重组质粒检测的Ct值批内和批间变异系数均小于2％;应用该法及OIE推荐的荧光PCR对1 215份样品进行平行检测,结果显示23份样品为阳性,1 192份样品为阴性,两种方法检测结果一致.本研究建立的方法能鉴别检测ASFV野毒株和基因缺失疫苗株(缺失MGF360-505R和/或CD2v基因),对将来基因缺失疫苗的推广应用及ASF疫情防控具有重要的意义.     

体外转录的自我复制型mRNA疫苗研究进展*

自我复制型mRNA是一种灵活的疫苗平台,该平台的开发基于甲病毒表达载体,其中复制必需基因得以完整保留,而结构蛋白基因则被来自病原的抗原基因替换。由于避免了病原培养、毒力返强和现存免疫的干扰,使其成为疫苗快速设计的理想平台。大量研究数据显示,此类疫苗可应用在人、小鼠、兔、猪、禽甚至鱼类体内诱导体液免疫和细胞免疫。过去,自我复制mRNA疫苗的研究采用重组单载体的模式,基因组骨架来源于辛德毕斯病毒、塞姆利基森林病毒和委内瑞拉马脑炎病毒。现在,反式复制型RNA和核酸修饰的反式复制型RNA作为下一代技术平台被寄予厚望。对基于甲病毒表达载体的mRNA疫苗技术的研究进展进行概述,重点介绍针对以流感病毒、新型冠状病毒和寨卡病毒等为代表的自我复制型mRNA疫苗研究现状,并探讨了该技术平台的未来发展方向。     

利用细菌人工染色体技术构建整合F基因的重组MDV疫苗株*

目的:预防马立克氏病病毒(MDV)和新城疫病毒(NDV)混合感染鸡引起的疾病,构建表达NDV F蛋白的MDV疫苗株CVI988 BAC重组载体,并包装成重组病毒,为疫苗免疫提供更多的重组疫苗选择。方法:首先利用PCR扩增带有卡那霉素(Kanamycin,Kana)抗性基因片段的F基因,采用同源重组的方法将其整合到CVI988 BAC上,进一步诱导I-SceI表达敲除Kana基因而获得重组质粒CVI988 BAC-F。通过磷酸钙法转染鸡胚成纤维细胞获得重组病毒。结果:Western blot和间接免疫荧光实验证实重组病毒能够表达F蛋白。病毒生长曲线和蚀斑大小测定结果表明,F基因的插入不影响病毒的体外增殖。结论:利用BAC技术成功构建了整合F基因的重组MDV病毒CVI988 BAC-F,为MDV重组疫苗研发,防控NDV与MDV共感染奠定了基础。