HBV感染者外周血TLR4mRNA表达与疾病进展关系研究

构建pUCm-TLR4质粒作为定量模板,采用实时荧光定量RT-PCR的方法检测 140 例HBV感染者外周血单个核细胞(PBMC)中TLR4mRNA的含量,并结合HBV感染者临床情况进行分析.HBV感染者PBMC中TLR4mRNA的表达范围是1.1×105～10.5×107 copy/μg RNA,显著高于健康对照组(4.5×105～1.25×106 copy/μg RNA),其中慢性乙肝组TLR4mRNA的表达明显高于慢性重型乙肝组(P＜0.05);HBV病毒载量的对数值与TLR4mRNA的含量存在负相关(r=-0.316,P＜0.01).结果表明,HBV感染者PBMC中TLR4mRNA的表达与疾病进展明显相关.     

脉冲电磁场对家猪淋巴细胞的细胞遗传学效应

以家猪外周血淋巴细胞为材料,研究了脉冲电磁场（pulsing electromagnetic fields,简称PEMFS)树细胞的遗传学效应,实验发现,100和200kHz的PEMFs对家猪的淋巴细胞照射培养12,24,48h后,染色体畸变（包括非整倍体,染色体断裂等）频率明显高于对照组（P＜0．05）,其中,56％的染色体或染色单体断裂和42％的间隙发生在家猪常见染色体脆性位点部位,同时, 经100kHz和200kHz的PEMFs照射48h后,淋巴细胞姐妹染色单体交换（SCE）频率也明显高于对照组（P＜0．05）,实验结果表明,PEMFS能诱导DNA损伤和染色体畸变。     

SLE患者外周血淋巴细胞膜K(V)通道电流的变化及意义

目的 :探讨系统性红斑狼疮 (SLE)患者外周血淋巴细胞膜电压依赖性钾 [K(V) ]通道电流的变化及意义。方法 :采用膜片钳全细胞电流记录方法 ,记录了SLE患者外周血淋巴细胞膜K(V)通道电流。结果 :SLE患者淋巴细胞膜K(V)通道电流明显下降 ,正常人该通道电流幅度为 (2 5 8.6± 112 .5 )pA ,SLE患者的为 (139.4± 5 8.5 )pA(P <0 .0 5 )。通道的其它特性包括激活电压、失活特性、通道关闭动力学特性及药理学特性未见变化。结论 :SLE患者细胞免疫功能下降可能与淋巴细胞膜K(V)通道电流幅度减小有关     

缺氧诱导因子-1α调节叉头框蛋白1表达促进大鼠外周血间充质干细胞缺氧存活

间充质干细胞(mesenchymal stem cells, MSCs)是再生医学中临床使用最多的干细胞之一。外周血间充质干细胞(peripheral blood mesenchymal stem cells, PBMSCs)以其获取简便、创伤小和具有多向分化能力等优势,在人类缺血性疾病的治疗方面具有重要应用前景。但尚未建立在缺氧环境下,使PBMSCs高存活和高扩增培养方法。本研究旨在探讨HIF-1α(hypoxia-inducible factor -1α, HIF-1α)通过调节叉头框蛋白1(forkhead box C1, FoxC1)表达,促进PBMSCs缺氧存活和扩增的作用。采取SD大鼠外周血,分离出单个核细胞(mononuclear cells, MNCs),培养第3代后得到MSCs,随机将细胞进行以下3种处理,并分组:未处理组(Control, CON)、HIF-1α激动剂组(dimethyloxallyl glycine, DMOG,0.1 mmol/L,DMOG组)和HIF-1α抑制剂组(BAY87-2243,50 nmol/L,BAY组),进行缺氧培养PBMSCs,观察各组不同时间点(1 h、10 h、20 h、30 h、40 h、50 h、60 h、70 h、80 h)PBMSCs凋亡和增殖情况。应用qRT-PCR和Western 印迹观察细胞FoxC1表达情况,及抗凋亡分子Bcl2和凋亡信号分子Bax和胱天蛋白酶3(caspase3)表达情况。MNCs经过3代培养后,可得到纯度较高的PBMSCs。但是,这些细胞在体外缺氧培养30 h即发生凋亡,但经HIF-1α激动剂DMOG能抑制其凋亡,能使PBMSCs缺氧延长到60 h以上。与CON组比较,DMOG处理使DMOG组PBMSCs活力升高2.6倍(P<0.001),细胞老化率(SA-β-gal阳性细胞百分率)降低70.1%(P<0.001),细胞凋亡率(Annexin V+PI+细胞百分率)减少64.6%(P<0.001)。加入HIF-1α抑制剂BAY87-2243则引起相反的变化:培养20 h后细胞增殖能力明显减弱,与CON组比较,BAY组细胞活力明显下降(P<0.001),老化率增加35.6%(P<0.001),细胞凋亡率增加38.1%(P<0.001)。进一步研究发现,DMOG可上调HIF-1α表达,促进FoxC1表达(DMOG组较CON组升高2.3倍,P<0.001),上调抗凋亡蛋白Bcl2(DMOG组较CON组升高3.8倍,P<0.001)、下调凋亡蛋白Bax和胱天蛋白酶3表达(各下降86.5%和85.0%,均P<0.001),而加入BAY87-2243显著降低HIF-1α、FoxC1和Bcl2表达,上调Bax和胱天蛋白酶3表达(与CON组比较,均P<0.001)。由此可见,HIF-1α-FoxC1是影响MSCs缺氧存活和增殖的重要信号途径,这有助于提高PBMSCs在缺氧环境中存活和扩增。     

游离线粒体拷贝数检测方法建立及应用

摘要 目的：线粒体在生理和病理过程中都起着重要作用,线粒体破碎后形成的游离线粒体与一系列疾病密切相关。然而,人体内游离线粒体的含量较低很难被稳定抽提且易降解等因素导致游离线粒体拷贝数检测具有极大挑战。本研究拟建立一种快速、准确检测外周血游离线粒体拷贝数定量PCR技术。方法：通过多重荧光定量PCR技术在SLAN?-96S全自动医用PCR分析系统上检测人外周血游离线粒体拷贝数,构建新的游离线粒体检测方案。游离核基因在人体外周血中的稳定性远大于游离线粒体,因此使用多拷贝参考基因YH-1（300拷贝）检测游离核基因作为对照组。结果：成功建立了核基因标准曲线和线粒体标准曲线,并筛选游离线粒体拷贝数检测最佳引物扩增片段长度为82bp、血清有效分离时间在2h内、血清最佳分离方案为1600 r/min 离心10 min再16000 r/min 离心10 min、磁珠法游离核酸抽提试剂盒抽提游离核酸得率最高的新流程。利用新方案对100 例不同年龄段的随机人群外周血抽提游离线粒体拷贝数进行检测,结果显示30-79岁游离线粒体拷贝数与年龄之间的相关性参数为｜R｜= 0.18、P value = 0.077,游离线粒体拷贝数与性别之间的相关性参数为｜R｜= 0.27、P value = 0.061即游离线粒体拷贝数与年龄和性别均无显著相关性,研究结果与报道一致。结论：表明优化后的方案可稳定检测游离线粒体拷贝数,提供了一种快速、准确检测游离线粒体拷贝数的方法。     

外周血T淋巴细胞亚群流式检测方法的优化及验证

为优化外周血T淋巴细胞亚群流式检测方法,采集小鼠肝素钠抗凝血,用FITC rat anti-mouse CD3、APC rat anti-mouse CD4和PE rat anti-mouse CD8a荧光抗体进行染色,裂解红细胞,通过流式细胞仪检测各亚类细胞占淋巴细胞百分比。从样本体积（50 μL和100 μL）、FITC rat anti-mouse CD3抗体的工作浓度（1.25~40.00 μg·mL^-1）、APC rat anti-mouse CD4抗体的工作浓度（0.625~20.000 μg·mL^-1）、PE rat anti-mouse CD8a抗体的工作浓度（1.25~40.00 μg·mL^-1）及红细胞裂解条件（时间和裂解次数）等方面对检测方法进行了优化,并验证方法的精密度（批内差异和批间差异）;同时对样品4 ℃放置24 h、室温放置24 h、染色处理后4 ℃放置24 h的稳定性进行验证。结果表明,50 μL抗凝血中加入终浓度1.25 μg·mL^-1 FITC rat anti-mouse CD3、1.25 μg·mL^-1 APC rat anti-mouse CD4和5.00 μg·mL^-1 PE rat anti-mouse CD8a,室温避光孵育30 min,加入红细胞裂解液,裂解5 min,用磷酸盐缓冲液（phosphate buffer saline,PBS）终止裂解后,重复裂解1次,再用PBS重悬后上机检测,批内差异和批间差异均<15%,符合标准。染色处理后样品4 ℃放置24 h可保持稳定性。对流式检测小鼠外周血T细胞亚群的基本方法进行全面优化及验证,旨在为临床前免疫毒性评价提供研究方法和实验数据,以及为流式细胞术分析临床血液淋巴细胞免疫表型的方法学研究提供参考依据。     

系统性红斑狼疮患者外周血单个核细胞Toll样受体9的表达及血清白介素-10水平的研究

目的:研究Toll样受体9(TLR-9)在系统性红斑狼疮(SLE)患者外周血单个核细胞(PBMCs)上的表达水平及SLE患者血清白介素-10水平,探讨发病机制。方法:从23例活动期、19例缓解期SLE患者和20例正常对照组中分离PBMCs,利用反转录-聚合酶链反应(RT-PCR)法检测PBMCs中TLR9 mRNA的表达水平,利用酶联免疫吸附试验法检测其血清白介素-10水平。结果:活动期SLE患者PBMCs的TLR-9mRNA表达高于缓解组(P<0.01)及正常对照(P<0.01),缓解期和正常对照组相比,差异无统计学意义(P>0.05)。SLE活动期患者血清IL-10水平显著高于缓解期患者(P<0.01),并均高于正常对照组(P<0.01)。结论:活动期SLE患者PBMC的TLR9 mRNA的表达水平增高;并且活动期及缓解期SLE患者血清IL-10水平升高可能与TLR9 mRNA表达的上调相关。     

乙肝病毒携带者外周血单核细胞miR-122表达与病毒增殖的关系研究

乙肝病毒携带者外周血单核细胞(Peripheral blood mononuclear cell,PBMC)中微小RNA(microRNA,miR)-122的表达情况及其与病毒增殖的关系,目前鲜有报道。本研究通过检测乙肝病毒携带者PBMC中miR-122的表达情况,探讨其与病毒增殖的关系。选取2017年1月～2018年8月石嘴山中心医院内科门诊的58例乙肝病毒携带者为观察组研究对象,按HBeAg的状态将其分为:HBeAg阳性(+)组31例,HBeAg阴性(-)组27例,同期选择健康体检者32例作为对照组,采用时间分辨荧光免疫分析(Timed-resolved fluoroimmunoassay,TRFIA)定量检测乙肝两对半,采用实时定量PCR法检测血清中HBV DNA拷贝数,采用qRT-PCR法检测PBMC中miR-122表达水平,采用Pearson相关性分析分析乙肝病毒携带者PBMC中miR-122水平与血清HBV DNA拷贝数的关系。结果显示,HBeAg(+)组HBV DNA拷贝数显著高于HBeAg(-)组(P0.05);观察组PBMC中miR-122表达水平显著高于对照组(P0.001);HBeAg(+)组外周血单个核细胞miR-122表达水平显著高于HBeAg(-)组(P0.001);乙肝病毒携带者PBMC中miR-122水平与HBV DNA拷贝数呈正相关(r=0.501,P0.001)。本研究中,与HBeAg(-)乙肝病毒携带者相比,HBeAg(+)乙肝病毒携带者病毒复制活跃,HBV DNA拷贝数升高,miR-122表达上调,提示乙肝病毒携带者PBMC中miR-122表达异常可能与病毒增殖有关。     

两种外周血 DNA 提取方法的比较

目的:外周血DNA的提取是研究乙型肝炎病毒相关临床疾病的基础,所提取DNA的质与量直接关乎下游研究的成败,经济、高效、便捷的外周血DNA提取方法对于疾病分子水平的研究尤为重要,本实验旨在比较两种外周血DNA提取方法,从而为临床研究提供有力的参考。方法:以外周抗凝血为试验样本,分别采用改良盐析法和DNA提取试剂盒法(硅胶柱纯化)进行基因组DNA的提取,通过分光光度仪测量DNA浓度和纯度,并进行PCR扩增及电泳实验。比较改良盐析法与试剂盒提取法(硅胶柱纯化)的效果。结果:试剂盒提取法(硅胶柱纯化)标本用量甚微,省时,提取DNA纯度高,步骤繁琐,PCR条带单一、亮度差;改良盐析法操作步骤少,提取DNA浓度高,PCR条带亮度佳、杂带多,耗时长。结论:两组方法各有优缺点,试剂盒提取法(硅胶柱纯化)可靠、快速,但所获DNA量少、极易降解,改良盐析法耗时,但所获DNA浓度高、量多,可根据实验时间与经费,实验所需的DNA纯度与浓度,提供的样本体积等不同的临床研究需求及条件来综合选择适宜的提取方法。     

基于流式细胞术快速检测人鼻黏膜组织淋巴细胞亚群的实验研究

目的：基于流式细胞术检测正常人的鼻黏膜组织中的淋巴细胞亚群(CD3+T、CD4+T、CD8+T、NK、CD19+B)的比例,初步探讨 鼻局部黏膜免疫功能的意义,为鼻局部黏膜免疫性疾病的研究提供更多的参考。方法：用鼻黏膜刮匙获取21 例正常人的鼻黏膜 组织,并抽取其外周血2 mL。采用流式细胞术分别检测其鼻黏膜和外周血中的淋巴细胞亚群(包括CD3+T、CD4+T、CD8+T、NK、 CD19+B)分别所占的比例。结果：鼻黏膜和外周血的淋巴细胞亚群存在很大差异,与外周血相比,CD3+T 比例增加（t=15.34,P<0. 0001),CD4+T 比例降低(t=5.952,P<0.0001)、CD8+T 比例增加(t=12.44,P<0.0001)、NK 比例降低(t=4.865,P<0.0001)、CD19+B 比例降 低(t=15.56,P<0.0001),CD4+T/CD8+T 降低。结论：流式细胞术可以用来检测鼻黏膜的淋巴细胞亚群,鼻黏膜的淋巴细胞亚群和外 周血的淋巴细胞亚群存在很大差异,这种差异体现鼻黏膜组织独特的局部黏膜免疫功能,本方法为变应性鼻炎的研究提供了新 的研究途径。