表达小鼠粒细胞-巨噬细胞集落刺激因子的重组非复制型痘苗病毒的构建及鉴定

目的:以非复制型痘苗病毒天坛株为载体表达小鼠粒细胞-巨噬细胞集落刺激因子(GM-CSF),并体外鉴定其生物学活性。方法:构建含有小鼠GM-CSF的重组痘苗病毒质粒,与非复制型痘苗病毒进行同源重组,筛选表达小鼠GM-CSF的重组痘苗病毒rNTVGMCSFLacZ,对目的基因及蛋白的表达进行鉴定,并在体外检测目的蛋白的生物学活性。结果:构建的重组病毒rNTVGMCSFLacZ中正确插入了小鼠GM-CSF基因,Western印迹结果表明其能正确表达GM-CSF,且在体外证明rNTVGMCSFLacZ表达的小鼠GM-CSF能分泌到细胞外,具有生物学活性。结论:构建了一株能分泌表达有生物学活性的小鼠GM-CSF的重组非复制型痘苗病毒。     

好客嗜酸两面菌W1寡营养酸性热泉环境的适应机制

【目的】从基因组水平揭示好客嗜酸两面菌(Acidianus hospitalis)W1对寡营养酸性热泉环境的适应机制。【方法】使用NCBI非冗余蛋白数据库、Uniport蛋白数据库以及Sulfolobus数据库对好客嗜酸两面菌W1基因组序列进行功能注释,使用KEGG数据库对基因组进行In slico代谢途径重构,在此基础之上,采用比较基因组学方法对代谢途径进行鉴定和完善。【结果】好客嗜酸两面菌W1具备多样化的代谢方式以适应寡营养酸性热泉环境。W1菌株通过3-羟基丙酸/4-羟基丁酸和乙二酸-4-羟基丁酸循环进行CO2固定、通过氧化还原型无机硫化物(Reduced inorganic sulfur compounds,RISCs)获取能量营自养型生长。但W1菌株与模式菌株Acidianus ambivalens的硫代谢方式不同,W1基因组中缺少编码亚硫酸-受体氧化还原酶(SAOR)、腺苷硫酸(APS)还原酶、硫酸腺苷酰转移酶(SAT)和腺苷硫酸:磷酸腺苷转移酶(APAT)的基因。此外,W1菌株可以通过非磷酸化的分支的ED途径和TCA循环进行葡萄糖代谢,糖类和氨基酸转运蛋白以及相应水解酶的存在表明W1能够利用部分有机物营兼性自养型生长。与A.ambivalens不同,W1菌株不能利用H2作为电子供体。【结论】多样化的代谢方式为好客嗜酸两面菌W1更好地适应寡营养酸性热泉环境提供了重要保障,对于W1菌株特有代谢方式的揭示也丰富了对于嗜酸两面菌(Acidianus)属物种代谢多样性的认知。     

嗜碱芽孢杆菌Bacillus sp. N16-5表达载体的构建

【目的】构建可以在嗜碱芽孢杆菌Bacillus sp.N16-5中表达外源基因的表达载体。【方法】以枯草芽孢杆菌表达质粒pHCMC04为基本骨架,删除木糖诱导的启动子和木糖阻遏蛋白基因,分别插入枯草芽孢杆菌组成型强启动子P43和嗜碱芽孢杆菌N16-5的组成型启动子P EF,构建表达载体pABN165P43和pABN165P EF;将绿色荧光蛋白基因gfp作为报告基因连接至表达载体得到pABN165P43-gfp和pABN165P EF-gfp,利用原生质体转化法将其转化至Bacillus sp.N16-5,通过荧光显微镜和多功能荧光读板仪检测报告基因的表达情况。【结果】所构建的表达载体pABN165P43-gfp和pABN165P EF-gfp可以在Bacillus sp.N16-5中表达报告基因gfp,荧光定量数据显示,在7.5 h左右开始检测到绿色荧光蛋白的表达,从7.5 h到12 h荧光强度随时间增长迅速并在12 h左右达到最大,最大荧光值在7000左右。【结论】成功构建了2个嗜碱芽孢杆菌Bacillus sp.N16-5表达载体,实现了外源基因在嗜碱芽孢杆菌中的表达。     

新疆阜康盐碱地可培养兼性嗜碱放线菌多样性及其酶活筛选

【目的】分析新疆阜康盐碱地环境可培养兼性嗜碱放线菌物种多样性及其产酶潜力。【方法】从阜康盐碱地环境共采集10份土样,采用纯培养物的16S rRNA基因序列同源性分析盐碱地兼性嗜碱放线菌物种多样性。对分离菌株进行淀粉酶、蛋白酶、纤维素酶和木聚糖酶酶活初筛。【结果】从10份土样中共分离到116株兼性嗜碱放线菌和4株耐碱放线菌,16S rRNA基因序列分析表明它们分布在放线菌门放线菌纲的8个目13个科22个属,其中53.3%的菌株为非链霉菌属和拟诺卡氏菌属的菌株。酶活初筛结果:淀粉酶、蛋白酶、木聚糖酶和纤维素酶的阳性率分别为35.8%、37.5%、28.3%、17.5%。【结论】阜康盐碱地生境蕴藏丰富的兼性嗜碱放线菌资源。兼性嗜碱放线菌是获得高活性酶的资源。本研究有助于认识高碱环境兼性嗜碱放线菌的多样性,为其资源的开发利用提供依据。     

嗜肺军团菌类真核效应蛋白LegK3抑制酿酒酵母的生长并影响其小泡运输途径

【目的】为了探索嗜肺军团菌类真核效应蛋白LegK3的功能,并进一步筛选得到其在宿主细胞内的作用靶点,我们利用酿酒酵母作为替代模型研究LegK3对宿主细胞的毒力效应,并针对其作用途径进行了初步分析。【方法】设计引物完整扩增LegK3、RalF、LidA的ORF,其中已知效应蛋白RalF、LidA基因作为对照实验组;扩增片段与酵母表达载体pESC-HK连接构建成重组载体,转化酿酒酵母菌株W303-1A,使用含2%半乳糖的选择培养基进行诱导培养,分别观察酵母细胞的生长抑制和CPY延迟情况;提取诱导前、后的酵母菌体总蛋白用c-myc抗体检测效应蛋白的表达情况;用anti-PGK、anti-CPY抗体检测酿酒酵母CPY的延迟情况。【结果】表达LegK3的酵母菌株出现了生长抑制的现象,并且CPY的成熟受到延迟影响。【结论】LegK3的异源表达能够抑制酿酒酵母的生长并延迟其囊泡蛋白CPY的成熟,推测LegK3可能通过作用于小泡运输途径来抑制真核宿主细胞的生长和分裂,以维持适合嗜肺军团菌繁殖的稳定胞内环境。     

Comparative genetic analysis of,Arabidopsis purple acid phosphatases AtPAP10, AtPAP12, and AtPAP26 provides new insights into their roles in plant adaptation to phosphate deprivation

Induction and secretion of acid phosphatases （APases） is thought to be an adaptive mechanism that helps plants survive and grow under phosphate （Pi） deprivation, in Arabidopsis, there are 29 purple acid phosphatase （AtPAP） genes. To systematically investigate the roles of different AtPAPs, we first identified knockout or knock-down T-DNA lines for all 29 AtPAP genes. Using these atpap mutants combined with in-gel and quantitative APase enzyme assays, we demonstrated that AtPAP12 and AtPAP26 are two major intracellular and secreted APases in Arabidopsis while AtPAPlo is mainly a secreted APase. On Pi-deficient （P-） medium or P- medium supplemented with the organophosphates ADP and fructose-6-phosphate （Fru-6-P）, growth of atpaplo was significantly reduced whereas growth of atpap12 was only moderately reduced, and growth of atpap26 was nearly equal to that of the wild type （WT）. Overexpression of the AtPAP12 or AtPAP26 gene, however, caused plants to grow better on P- or P- medium supplemented with ADP or Fru-6-P. Interest-ingly, Pi levels are essentially the same for the WT and overexpressing lines, although these two types of plants have significantly different growth phenotypes. These results suggest that the APases may have other roles besides enhancing internal Pi recycling or releasing Pi from external organophosphates for plant uptake.     

小剂量rhGM-CSF化疗前应用的临床研究

目的:探讨小剂量重组人粒细胞巨噬细胞集落刺激因子(rhGM-CSF)化疗前应用在减轻骨髓抑制、缩短住院时间、减少医疗费用方面的作用。方法:实验组化疗前48小时GM-CSF300μg皮下注射1次,出现骨髓抑制后实验组与对照组均给予rhGM-CSF300μg皮下注,1次/日,直至WBC≥4.0×109/L。结果:实验组的白细胞减少、粒细胞减少及血小板下降均较对照组轻,(P0.05),实验组白细胞恢复时间短于对照组,(P0.05),住院天数及药费也存在显著性差异(P0.05)。结论:化疗前给予rhGM-CSF,可以有效地降低骨髓抑制的发生率及发生程度,缩短骨髓恢复时间,在降低医疗费用、加快床位周转、提高病床使用率方面也显示出一定的优势。     

大鼠尺神经一级传入纤维在脊髓胶状质定位投射的定量分析－FRAP法

本实验按照跨神经节溃变的原理,用抗氟化物酸性磷酸酶（ＦＲＡＰ）法和显微测量,对大鼠尺神经一级传入纤维在脊髓胶状质（ＳＧ）的定位投射进行了定量分析。大鼠尺神经向ＳＧ的纵向投射主要为Ｃ６～Ｔ１,少数实验动物投向Ｔ２上、中段。Ｃ６～Ｔ２各节段ＳＧ水平向“眉毛状反应带”长所测均值（ｍｍ）分别为０．９９６、０．９９６、０．９１８、０．７８３、０．６４２,而尺神经向Ｃ６～Ｔ２各节段ＳＧ水平向投射所测均值（ｍｍ）分别在０．３５４～０．５３６、０．３３３～０．５４２、０．２１４～０．５１５、０．１４４～０．３１９、０～０．２２３的范围,显示了反应带从ＳＧ的中间区逐渐移至内侧区。     

细胞的冰冻和解冻

我国东北寒带地区嗜冷鱼类——鲛康,可以在-25℃的冰晶中吊挂休眠120d,仍能存活。这种顽强的生命现象在动物界实属少见。从分子水平上对其冰冻和解冻的机理进行概述。     

嗜酸乳杆菌NCFM对Caco-2细胞基因表达谱的影响

摘要：【目的】嗜酸乳杆菌NCFM作为一株具有良好益生功能的模式菌株,采用基因芯片技术对其作用后的宿主细胞基因的变化情况进行分析,在生物、食品等领域具有较大研究价值。【方法】将嗜酸乳杆菌NCFM和Caco-2细胞共同培养2h,提取Caco-2细胞的总RNA,并将RNA反转录成cDNA,与Human Genome U133 Plus 2.0 Array基因表达谱芯片杂交,杂交后进行图像扫描和数据分析,并采用Real-time RT PCR方法对差异表达的基因进行验证。【结果】采用基因芯片方法检测了Caco-2细胞经嗜酸乳杆菌NCFM作用2h后的基因表达变化,发现差异表达基因为508个,其中有473个基因上调,35个基因下调,初步推测Caco-2细胞能诱导多个基因的表达,以发挥嗜酸乳杆菌NCFM的益生功能。并且经Real-time RT PCR验证,表达差异显著的3个免疫调节相关基因CCL2、PTX3和TNFRSF9的确在嗜酸乳杆菌NCFM作用期间高表达。【结论】以上这些结果促进了对嗜酸乳杆菌NCFM益生功能的认识,也为揭示该乳酸菌的作用机理提供了理论基础。