TLR3免疫识别dsRNA病毒的分子机制

1984年,果蝇的Toll样蛋白被发现。13年后,人们发现了第一个与果蝇Toll蛋白同源的人Toll样受体(toll like receptor,TLR)蛋白(hTLR4)。迄今,已有10种TLR蛋白(即hTLR1～10)被发现,它们代表了一类保守的受体家族,分别识别不同的抗原。其中TLR3能专一性地识别双链RNA(double stranded RNA,dsRNA),通过依赖MyD88的信号通路及不依赖MyD88的信号通路,     

高致病性H5亚型禽流行性感冒病毒血凝素单克隆抗体的制备与初步应用

以禽流感病毒株Ck/HK/Yu22/02（H5N1）作为免疫原,利用常规杂交瘤技术和血凝抑制试验法成功地筛选出6株稳定分泌抗高致病性H5亚型禽流感病毒血凝素的单克隆抗体（单抗）,分别命名为2F2、3C8、3FC1、7C6、10HD4和13G4.经血凝抑制试验法分析,结果发现这6株单抗具有特异性高、反应性强、识别谱宽且互补等特点.基于单抗2F2,初步建立了三种H5N1病毒诊断方法,经评估证实均具有很好的特异性.由此说明,研究制备的抗H5亚型禽流感病毒血凝素单抗可适用于H5N1病毒的诊断.     

北京地区呼吸道合胞病毒分离株G蛋白基因遗传变异特性研究

为了解北京地区人呼吸道合胞病毒（human respiratory syncytial virus,HRSV）的遗传变异和分子流行病学特征,首次对北京地区2003～2004年63株HRSV分离株进行了G基因3’末端的第2个高度变异区的序列测定,并进行了基因分型和遗传变异的分析。使用不同的型特异性引物对GPA—F1和GPB-F1分别扩增A、B血清型HRSVG基因3’末端核苷酸序列,特异性扩增产物和随后的序列测定结果均显示,北京地区2003～2004年63株HRSV毒株中,96．8％（61／63）为A血清型,3．2％（2／63）为B血清型,说明北京地区在2003～2004年间存在HRSVA、B血清型共循环,但以A血清型病毒为主。分别对北京流行的A和B血清型病毒进行了基因亲缘性关系分析,结果提示,61株北京A血清型分离株全部为GA2基因型;2株B血清型分离株为GB3基因型。由此看来,GA2基因型是北京地区2003～2004年的优势流行基因型。北京61株GA2分离株之问核苷酸和氨基酸同源性分别在87．8％～100％和77．9％～100％之间;2株B血清型分离株之间核苷酸和氨基酸同源性分别为94．7％和88．1％。这说明在2003年和2004年有很多个不同的GA2基因型HRSV毒株在北京地区共循环,北京地区的HRSV流行存在着许多由不同病毒株引起的传播链。B血清型分离株Beijing04-11于G基因3’末端含有一个60个碱基的重复序列,这是HRSV多聚酶易于重复复制限定序列的一个极端的例子,有可能是HRSV逃逸免疫压力而不断进化的一种方式。该研究首次对北京地区2003年和2004年流行的HRSV进行了基因分型和遗传变异的研究,对于了解北京HRSV流行株的基因特征具有重要意义,可以为北京乃至中国疫苗株的选择提供参考依据,从而指导HRSV的免疫预防控制。     

汉滩病毒S基因的分段表达及其线性和构象型抗原表位分析

构建汉滩病毒76—118N蛋白及其分别从N-端和C-端缺失的共6个突变体,在大肠杆菌BL-21中进行表达,并对其中一些蛋白进行了纯化。通过Western blot、酶联免疫吸附试验(ELISA)进行汉滩病毒N蛋白的抗原表位分析,N蛋白及6个缺失突变体都与组特异性抗体L13F3呈阳性反应,而缺失突变体与型特异性抗体AH30呈阴性反应。构建汉滩病毒76—118N蛋白及其6个缺失突变体的真核表达载体,并在COS-7细胞中进行表达。通过间接免疫荧光试验(IFA)进行汉滩病毒N蛋白的抗原表位分析,病人血清与真核表达的N蛋白及6个缺失突变体呈阳性反应。而仅有N蛋白及缺失N端1～30位氨基酸序列的NPN30与型特异性抗体AH30呈阳性反应。证实组特异性抗体L13F3结合的抗原表位位于N端1～30位氨基酸;而C端抗原表位对于型特异性抗体AH30与N蛋白的识别和结合具有重要意义,缺失N端100位氨基酸序列可能破坏羧基端构象型表位,也可以影响N蛋白与AH30的结合。     

乙型脑炎病毒表达载体的研究

用RT-PCR方法分段扩增了乙型脑炎病毒SA14—14—2疫苗株5′、3′NCR,利用融合PCR技术在5′、3′NCR之间引入BamHⅠ酶切位点,将5′NCR置于T7启动子控制之下,构建乙脑病毒微复制子表达载体pMR。分别将绿色荧光蛋白(GFP)和汉滩病毒核蛋门编码区基因插入到pMR中,构建两种表达外源基因的乙脑病毒微复制子表达载体：pMR—GFP和pMR-84FliS。绎荧光显微镜直接观察、Western blot、ELISA等方法检测,证实外源基因能够在辅助病毒SA14—14—2感染的BHK-21细胞中表达。     

人乳头瘤病毒11型L1主要衣壳蛋白的B细胞表位多肽作为疫苗的研究

分析了人乳头瘤病毒11型(HPV11)L1主要衣壳蛋白的B细胞优势表位,并以此为基础研制表位多肽疫苗。研究中采用Goldkey和．PC／Gene软件系统,分析HPV11的L1主要衣壳蛋白的二级结构、抗原性、B细胞表位,并引人氨基酸抗原性指数,综合评估其B细胞优势表位。Fmoc固相合成表位多肽,高效液相层析方法纯化,毛细管电泳分析其纯度。与0．2ml佐剂完全乳化后,按50μg／只的剂量免疫小鼠,进行动物水平的免疫效果评价。取免疫小鼠血清,与HPV11 DNA阳性的尖锐湿疣患者的疣体上清液结合,鉴定免疫后小鼠所产生抗体的特异性。发现HPV11的L1主要衣壳蛋白的第426～439位和第487～501位具有较高的免疫原性,可明显诱导小鼠血清抗体滴度升高,且该抗体与人尖锐湿疣的疣体组织上清液呈阳性反应。说明所选这两个肽段为HPV11的L1主要衣壳蛋白的B细胞优势表位,但是否具有功能特异性,尚需进一步研究。     

猪瘟病毒感染性cDNA克隆的构建及其致病性

为了建立研究猪瘟病毒的技术平台,利用RT-PCR技术构建了猪瘟病毒中国石门株(Shimen)的全长有感染性cDNA克隆pT7SM。通过体外转录线性化的pT7SM并将转录的RNA转染至PK-15细胞中,获得了猪瘟病毒粒子。再用间接免疫荧光法测定了其生长曲线,通过电镜观察到重组病毒呈球形,具有囊膜结构。进一步把获得的猪瘟病毒粒子感染非免疫实验猪,结果子代病毒与石门株类似,对非免疫实验猪有强烈的致病性,证明该全长cDNA克隆可靠稳定,忠实地保留了石门株病毒的感染性和致病特征。由此为进一步探讨猪瘟病毒的致弱机制及病毒与机体相互作用的机制打下了良好的基础。     

Sabin2型脊髓灰质炎病毒适应人胚肺二倍体细胞不同代次病毒滴度与5′端非编码区变异关系

脊髓灰质炎病毒(Poliovirus)是一类无包膜单股正链RNA病毒,基因组长约7．5kb。其5′端非编码区由约742个核苷酸长,主要与病毒RNA复制、蛋白翻译起始、病毒颗粒的装配及病毒的细胞适应减毒及神经毒力密切相关。我们研究发现,脊髓灰质炎病毒(Sabin株)在人胚肺二倍体细胞(KME17)上致细胞病变较猴肾细胞慢,病毒产量亦明显低于恒河猴肾细胞培养,国内外也有类似的报道。     

从噬菌体展示抗体文库筛选对虾白斑综合征病毒的单链抗体

对虾白斑综合征是一种严重危害对虾养殖业的病毒性疾病.由于目前对其病原体对虾白斑综合征病毒（WSSV）的研究不够深入,所以对WSSV的有效防治仍然是一大难题.为此,用完整的对虾白斑综合征病毒粒子作为靶抗原固相包被,淘选噬菌体展示单链抗体文库,得到两个能够与WSSV结合的单链抗体：E2和H4.单链抗体H4能够结合病毒并抑制病毒对原代培养的对虾淋巴细胞的感染,这些结果表明此单链抗体具有开发为诊断试剂盒和抗病毒药物的潜力.     

我国1999—2003年间ALV—J野毒株gp85基因变异趋势

通过接种鸡胚成纤维细胞（CEF）、间接免疫荧光试验（IFA）和聚合酶链式反应（PCR）,连续五年从全国各地的送检病料中分离到14株J亚群白血病病毒（ALV-J）。为了动态观察ALV-J囊膜表面结构蛋白（GP85）的变异情况,对这14株野毒株的囊膜糖蛋白基因（env）进行了克隆和测序,将它们与HPRS-103株的GP85的氨基酸序列进行了比较,结果表明：ALV-J的囊膜表面结构蛋白发生了很大的变异,而且这些变异主要集中在高变区hr1、hr2和vr3;这些野毒株GP85的氨基酸序列的同源性在86．6％～100％之间（从同一鸡场中分离到的两株ALV-J即BJ00302与BJ0303的同源性为100％,其它毒株之间的同源性均小于100％）;有义突变与沉默突变的比例显示这3个高变区极有可能是免疫选择压作用的位点。