应用基因敲除快速构建大肠杆菌突变体改造脂肪酸代谢途径

【目的】基因敲除技术是研究基因功能的重要手段。我们试图建立一种快速、高效的大肠杆菌基因敲除方法。【方法】利用大肠杆菌(Escherichia coli)BW25113单基因缺失体Keio文库,将经典的Red同源重组技术与P1噬菌体转导技术相结合,对E.coli MG1655脂肪酸代谢基因进行快速敲除。【结果】获得了大肠杆菌β-氧化途径的缺失菌株△fadD、△fadE和△fadD-△fadE;脂肪酸合成途径缺失菌株△fabH、△fabF和△fabH-△fabF。敲除fadD和fadE对生长情况没有影响;敲除fabH后,生长速度明显减慢;敲除fabF对生长几乎没有影响。FadD、FadE及双敲缺失体的脂肪酸含量18.2 mg/L、20.0mg/L和19.2 mg/L,略高于野生型17.5 mg/L;FabH、FabF及双敲缺失体的含量分别为12.6 mg/L、15.2 mg/L和11.2 mg/L,明显低于野生型。【结论】在单基因突变体文库基础上,利用P1噬菌体转导、Red同源重组和抗性基因消除进行基因敲除,简化了构建大肠杆菌单基因和多重突变体的方法。     

人参皂甙Rb1对心力衰竭大鼠蛋白激酶R样内质网激酶途径的影响

目的探讨人参皂甙Rbl（Gs—Rbl）改善阿霉素所致心力衰竭（HF）效应是否与调整蛋白激酶R样内质网激酶（PERK）通路有关。方法阿霉素（Adr）诱导的HF大鼠随机分为HF组（n=15）和Gs．Rbl组（70rng／kg／d,n=17）,另随机选取同龄大鼠作为对照组（n=10）。干预结束并进行心脏超声检查后,TUNNEL检测心肌细胞凋亡率（AR）,Western blot和Rt-PCR检测葡萄糖调节蛋白78（GRP78）、PERK、p-PERK、真核细胞起始因子2-（elF2a）、p-elF2a、C／EBP同源蛋白（CHOP）和cleavedcaspase-12。结果1．Adr干预成功构建HF模型,Gs—Rbl显著提高左室射血分数（LVEF）和降低心肌细胞AR（P〈O．01）;2．HF组GRP78mRNA和蛋白均显著高于对照组,Gs—Rbl显著低于HF组和对照组二组的表达（P〈0．01）;3．Gs—Rbl显著降低HF大鼠PERK和p-PERK表达（P〈0．01）;4．HF导致elF2amRNA和蛋白、p-elF2a显著升高,Gs—Rbl显著下调三者的表达（P〈O．01）;5．HF组CHOPmRNA和蛋白显著高于对照组,Gs—Rbl组显著抑制其表达（P〈0．01）;6．Gs—Rbl显著抑制阿霉素所致的caspase-121TIRNA和cleaved caspase-12蛋白表达（P〈0．01）。结论Gs—Rbl通过调节PERK内质网通路介导其改善HF效应。     

青海湖裸鲤三磷酸甘油醛脱氢酶基因的克隆和表达特性

目的开展青海湖裸鲤基础生物学特征和适应低氧、低温、高盐度的分子机理的研究,揭示青海湖裸鲤的基本生命活动规律,为该鱼种的资源保护和人工增殖放流提供理论依据。方法通过RT—PCR和RACE技术,得到了青海湖裸鲤三磷酸甘油醛脱氢酶（Gp—GAPDH）两种旁系同源体的完整编码序列,分别命名为Gp-GAPDHα（JX287372）和Gp-CAPDHβ（JX287373）。通过半定量RT-PCR分析白．GAPDHa和Gp-GAPDHβ在不同的组织和胚胎发育不同阶段的表达量。结果Gp—GAPDH两种异形体蛋白质序列的同源性为72％,所编码的氨基酸序列与其他物种具有较高的相似度。两种旁系同源体基因在不同组织和胚胎发育不同阶段表达水平各有所不同,其中Gp—GAPDHα在胚胎发育不同阶段的表达量存在极为显著的差异。结论在青海湖裸鲤胚胎发育研究中,Gp-GAPDHα不适合作为参照基因使用,两者的功能则需要做进一步研究。     

六盘水酸模属植物资源的初步调查研究

通过野外调查、标本采集、分类学研究及资料考证,对六盘水酸模属植物的资源进行了调查.结果表明,六盘水有酸模属植物7种,其中钝叶酸模(Rumex obtusifoliusL.)为贵州省的分布新纪录,并对酸模属植物药用价值、食用价值及生态价值等进行了分析.     

New Replacement Name for Rana paradoxa Mocquard, 1890 with Designations of Lectotypes for Rana paradoxa and Rana conspicil- lata Giinther, 1872： Both Synonymized with Limnonectes kuhlii （Tschudi, 1838） （Dicroglossidae： Dicroglossinae）

Fanged frogs, now called Limnonectes kuhlii, from Borneo are remotely related to true Javanese L. kuhliL For future taxonomy of Bornean fanged frogs, we fix the nomenclatural status of two existing names, Rana conspicillata Giunther, 1872 and Rana paradoxa Mocquard, 1890. Morphological comparison of the type-series revealed heterospecific relationships of the two species. For R. conspicillata, we designate BMNH 1947.2.29.20 as the lectotype, and for R. para doxa, we also designate MNHN 1889.222 as the lectotype and propose a replacement name Limnonectes mocquardi, in order to stabilize their nomenclature.     

arcA基因提高大肠杆菌对有机溶剂的耐受性

【目的】将来源于恶臭假单胞菌(Pseudomonas putida JUCT1)的基因arc A(编码精氨酸脱亚胺酶)整合到Escherichia coli JM109(DE3)基因组中,以提高该菌对有机溶剂的耐受性。【方法】以P.putida JUCT1的基因组为模板扩增基因arc A,并与p ET-20b(+)连接后导入E.coli JM109(DE3)中,验证该基因提高E.coli JM109(DE3)对有机溶剂的耐受性。利用Red同源重组的方法将arc A整合到E.coli JM109(DE3)基因组中。【结果】E.coli JM109(DE3)/p ET-20b(+)-arc A在添加了2.0%(体积比)环己烷、0.1%(体积比)甲苯、4.0%(体积比)萘烷和0.1%(体积比)丁醇的培养基中培养8 h后,其OD660由初始的0.2分别上升到0.8、0.9、1.8和1.3。将arc A成功整合到E.coli JM109(DE3)基因组中,获得了具有较好遗传稳定性的溶剂耐受E.coli JM109(DE3)宿主菌株。【结论】外源基因arc A能提高大肠杆菌菌株的有机溶剂耐受性,为工业化应用中耐溶剂微生物菌株的构建提供了实验依据和理论基础。     

紫花苜蓿赤霉素受体基因的克隆及表达分析

赤霉素受体(GID)是赤霉素信号转导途径的重要成员,直接影响着赤霉素对植物体效应的发挥。该研究利用同源克隆的方法,首次从紫花苜蓿中克隆得到1个赤霉素受体基因,命名为MsGID1b。序列分析发现,MsGID1b基因开放阅读框长度为1 053bp,编码350个氨基酸,推测其蛋白质分子量为39.839kD,是一个无信号肽和跨膜结构的亲水性蛋白。序列比对结果表明,MsGID1b基因与蒺藜苜蓿MtGID1b基因的核苷酸序列相似性为98%,氨基酸序列相似性为99%,且具有HSL家族典型的HGG和GXSXG保守结构域及GA、DELLA蛋白结合位点。荧光定量PCR分析表明,MsGID1b基因在紫花苜蓿各组织中的表达丰度依次为:根盛花初花茎叶荚果;经GA3、ABA、NaCl、PEG和黑暗诱导后该基因表达上调,尤其是在GA3诱导下,MsGID1b基因的表达量一直维持在较高水平,表明MsGID1b基因可能参与紫花苜蓿的抗逆调控。     

基于CRISPR/Cas9技术的基因敲入/敲除策略

成簇的规律间隔性短回文序列(CRISPR)基因编辑系统,因其设计简单操作方便和无种属限制,已成为一种广泛应用的基因组定点编辑工具,在复杂的基因组编辑,例如基因的人源化改造以及条件等位基因的构建中有所应用。在自然界中,CRISPR系统拥有多种类别。其中,CRISPR/Cas9系统是研究最深入、应用最成熟的一种。本文针对CRISPR/Cas9系统,分别从基因敲入/敲除片段的大小、同源臂长短、构型即递送方式等技术环节进行综述,阐述不同设计及操作条件下由CRISPR/Cas9系统介导的基因敲入/敲除的效率差异。     

西藏东南部柏木属群落类型及物种多样性

西藏东南部柏木属植物群落是青藏高原天然林资源的重要组分,在维持高原生物多样性与生态安全方面作用显著.为明确其群落类型及物种多样性,本研究通过在米林县、朗县和波密县设置典型样地和划分群落类型,分析了不同群落物种组成、物种多样性指数及建群种径级结构.结果表明: 柏木属植物群落可划分为4个群落类型:西藏柏木-柳叶忍冬+绒毛山梅花-凤尾蕨+紫马唐群落(群落Ⅰ)、巨柏-圆锥山蚂蝗+砂生槐-线形草沙蚕+芸香草+固沙草群落(群落Ⅱ)、巨柏-甘肃野丁香-杂配藜+固沙草群落(群落Ⅲ)、巨柏-小蓝雪花-藏沙蒿+固沙草+蒺藜群落(群落Ⅳ).各群落Margalef丰富度指数、Shannon多样性指数、Pielou均匀度指数及种间相遇机率指数均表现为:群落Ⅰ＞群落Ⅱ＞群落Ⅲ＞群落Ⅳ.4个群落的建群种幼龄级个体多而中老龄级少,植株由幼龄级向中龄级过渡阶段死亡率较高,柏木属植物种群呈衰退趋势.