人Calpain1与心脏结构蛋白的相互作用

为探讨人calpain1与心脏结构蛋白之间的相互作用 ,采用酵母双杂交体系筛选与人calpain1大亚基相互作用的蛋白质 ,通过DNA序列测定及BLAST分析同源性 ,获得了阳性克隆 12 (pACT2 12 ) ,16 (pACT2 16 ) ,2 2 (pACT2 2 2 )和 37(pACT2 37)等 .12和 2 2分别与人心脏α肌动蛋白 (humancardiacmusclealpha actin ,ACTC)有 99%和 10 0 %同源性 .16和 37分别与人心脏的肌球蛋白结合蛋白C(humancardiacmyosin bindingproteinC ,MYBPC3)和人α2 辅肌动蛋白 (humancardiacalpha 2actinin ,ACTN2 )有 10 0 %同源性 .这些阳性克隆均属于心脏中心肌细胞的结构蛋白 ,参与心肌细胞的收缩运动 .为鉴定calpain1大亚基的哪些结构域可能参与这些相互作用 ,阳性克隆再分别与含有人calpain1大亚基结构域Ⅱ、Ⅲ、Ⅳ的诱饵质粒共同转化AH10 9进行酵母双杂交 ,发现pACT2 12(ACTC)和pACT2 16 (MYBPC3)均能与全长人calpain1大亚基的结构域Ⅱ和Ⅲ相互作用 ;pACT2 16(MYBPC3)还能与大亚基的结构域Ⅳ作用 ;而pACT2 37(ACTN)虽能与全长人calpain1大亚基作用 ,却不与其单独的结构域Ⅱ、Ⅲ或Ⅳ发生作用 .定量分析阳性克隆与人calpain1大亚基作用的强弱的结果显示 ,pACT2 12、16或 37分别与诱饵质粒pGBKT7 CANP共同转化AH10 9后     

酵母双杂交文库筛选及hTRIP15与Y盒结合蛋白-1相互作用的探讨

为探讨甲状腺素受体相互作用蛋白(hTRIP15)是否与其他核蛋白发生相互作用．以hTRIP15作为“诱饵”,用酵母双杂交技术筛选人肝cDNA文库,在高严格度选择培养基(SD-Trp-Leu-Ade-His)上长出的克隆773个,再经β-gal表达和PCR等技术进一步缩小范围,经Blastn搜寻最终显示2个重复克隆编码一种共调节辅因子——Y盒结合蛋白-1(YB-1)．将插入序列与全长YB—1比较发现进入ORF内230bp,插入序列编码82aa．该蛋白称为YB-1-p,经蛋白体外翻译及GST-pulldown试验讧实YB-1-P与hTRIP15发生相互作用．提示hTRIP15可通过与YB-1相互作用,参与调控MHCⅡ及TSH受体等甲状腺细胞重要基因表达．     

用酵母双杂交系统筛选影响apo-AI和SR-BI相互作用的苦豆子活性成分

本文通过将苦豆子总提取物及其分离得到的10个组分加入含有AH109菌株(携带大鼠apo-AI及其受体SR-BI全基因)的培养基中,利用报告基因半乳糖苷酶活力有无变化来寻找能够促进大鼠载脂蛋白apo-AI及其受体SR-BI相互作用的激动剂.经测试,我们观察到苦豆子总提取物(K-1),在上述系统中能显著增强这两种蛋白的相互作用.继续用硅胶柱层析方法从k-1中分出10个组分后,利用酵母双杂交系统再次筛选,发现有五个组分能增强两种蛋白的相互作用,(与空白对照组相比其中有两个组分有极显著差异)另外三个组分显著地抑制上述两种蛋白的相互作用,剩下的两个组分则没有差异.该实验还提示该酵母双杂交系统可能成为一种跟踪具有调脂功能的先导化合物的有效方法.     

雄激素受体辅助调节因子267-a的相互作用蛋白——死亡受体6的鉴定

为了研究新发现的雄激素受体辅助调节因子267-a(androgenreceptor-associatedcoregulator267-a,ARA267-a)的功能,以含有编码ARA267-a中4个PHD和1个SET结构域的cDNA片段构建诱饵重组表达质粒,采用酵母双杂交系统从人脑cDNA文库中筛选与之有相互作用的蛋白质.在筛选文库的阳性克隆中,经过DNA测序和在GenBank中的同源核苷酸序列比对,发现死亡受体-6(deathreceptor-6,DR6)是ARA267--PHD-SET的相互作用蛋白之一.通过再次酵母双杂交、体外免疫共沉淀和哺乳动物细胞双杂交证实DR6的胞内区可以与ARA267-a的PHD-SET结构域相结合.DR6是肿瘤坏死因子受体家族成员之一,它的胞内区含有死亡结构域,参与细胞凋亡信号的传导.这个研究结果提示:有ARA267-a参与的雄激素-雄激素受体通路与有DR6参与的细胞凋亡通路之间可能通过ARA267-a和DR6的相互作用而产生交叉联系.     

雄激素受体辅助调节因子267-α的相互作用蛋白

为了研究新发现的雄激素受体辅助调节因子267-α (androgen receptor-associated coregulator 267-α, ARA267-α)的功能, 以含有编码ARA267-α中4个PHD和1个SET结构域的cDNA片段构建诱饵重组表达质粒, 采用酵母双杂交系统从人脑cDNA文库中筛选与之有相互作用的蛋白质. 在筛选文库的阳性克隆中, 经过DNA测序和在GenBank中的同源核苷酸序列比对, 发现死亡受体-6(death receptor-6, DR6)是ARA267-α-PHD-SET的相互作用蛋白之一. 通过再次酵母双杂交、体外免疫共沉淀和哺乳动物细胞双杂交证实DR6的胞内区可以与ARA267-α的PHD-SET结构域相结合. DR6是肿瘤坏死因子受体家族成员之一, 它的胞内区含有死亡结构域, 参与细胞凋亡信号的传导. 这个研究结果提示: 有ARA267-α参与的雄激素-雄激素受体通路与有DR6参与的细胞凋亡通路之间可能通过ARA267-α和DR6的相互作用而产生交叉联系.     

利用随机多肽文库研究ZO-1中PDZ3结构域的配体结合特点

建立一种研究PDZ结构域配体结合特点的简单方法 .利用酵母双杂交技术从随机多肽文库中寻找所有可能与ZO 1中PDZ3结构域结合的C末端序列 ,从现有蛋白质数据库中检索所有具有该C末端蛋白 .利用液体培养物 β 半乳糖苷酶检测实验 ,比较文库中筛选的C末端序列和已知的PDZ3结构域结合配体———JAM的C末端 (SFLV)与PDZ3结构域结合的强弱 .共筛选到 3个阳性克隆 ,其C末端序列分别为 LGWV、 LVWV和 DEWV .前 2者属于第二类PDZ结构域 ,后者属于第三类 .蛋白质数据库检索结果表明 ,有多个蛋白质具有 LGWV、 LVWV末端 ,没有检索到任何具有 DEWV末端的蛋白质 .结合强度实验结果表明 ,它们与PDZ3结构域结合强度依次为 DEWV > LGWV > LVWV > SFLV ,说明筛选的 3个C末端除了反映ZO 1中PDZ3结构域可能的潜在结合配体外 ,也有可能成为JAM蛋白阻断性试剂甚至药物的重要组成部分之一 .利用随机多肽文库 ,可以尽可能寻找所有可能与PDZ结构域结合的C末端序列 ,大大提高了基因文库筛选的效率     

两种水稻GDP解离抑制蛋白基因的分离及特征分析

以Rho家族成员OsRacD为诱饵 ,采用酵母双杂交体系 ,分离到两种与OsRacD互作的水稻RhoGDP解离抑制蛋白的基因 ,分别命名为OsRhoGDI1和OsRhoGDI2 .酵母体内结合和GSTpulldown分析结果显示 ,OsRhoGDI1和OsRhoGDI2与野生型和组成型激活的OsRacD都能结合 ,且不依赖GDI的N端部分序列 ;GDI和Rho的结合具有一定的特异性 .两种GDI在水稻根、地上组织和幼穗等多种组织和器官都有表达 ,但在表达特征上存在明显差异 .研究证实 ,在水稻中存在着调控RhoGTPases的GDP解离抑制蛋白基因家族 ,为Rho蛋白功能及相关信号通路的研究奠定了基础     

G-CSF受体胞内区结合蛋白COXⅡ的分子克隆及相互作用验证

为寻找与G-CSF受体胞内区相互作用的蛋白．探讨其可能的信号传导机制,应用酵母双杂交技术从小鼠胎肝文库中筛选到与G-CSF受体胞内区相互作用的蛋白—细胞色素C氧化酶Ⅱ亚基(COXⅡ);采用PCR技术从小鼠肌肉cDNA中克隆到全长COXⅡ,并应用哺乳动物细胞双杂交实验验证了COXⅡ与G-CSF受体胞内区相互作用。构建了一系列G-CSF受体胞内区短截体．应用细胞双杂交技术确定COXⅡ主要结合于G-CSF受体的Box3区：随后构建了COX Ⅱ-GFP融合表达载体,观察到COXⅡ在COS7细胞中为全细胞分布．这些结果为揭示COX Ⅱ的新功能及发现G-CSFR新的信号传递通路提供了线索。     

应用酵母双杂交技术寻找与GGNBP相互作用的蛋白质

生殖细胞缺陷症(gcd)小鼠突变体是20个世纪90年代初发现的一种不育突变小鼠,其不育原因是由于其胚胎期原始生殖细胞的数目低于正常。FancL(也叫Pog)的缺失是引起gcd突变小鼠的原因,FancL基因缺失后可能影响了小鼠胚胎期原始生殖细胞的增殖／存活和成年期小鼠精母细胞的减数分裂。FANCL是一种含有PHD结构域的泛素E3连接酶,是Fanconi贫血复合物的组分之一。在生殖细胞中,FANCL与GGN1和GGN3相互作用,GGN1和GGN2又与一种新的蛋白质GGNBP特异作用。但GGNBP蛋白的功能还不清楚。为了研究GGNBP的功能以及揭示更多的参与该过程的蛋白质,运用Clontech公司新开发的第3套酵母双杂交系统,以GGNBP为诱饵从成年小鼠睾丸cDNA库中筛选与其相互作用的蛋白质基因,发现了一个主要在睾丸中表达的新的基因,其编码的蛋白质产物在酵母系统中与GGNBP特异作用。