成体干细胞向肝细胞分化

成体干细胞跨越胚层限制分化为其他胚层来源的细胞,对揭示不同胚层细胞间相互分化的生物学意义和机制具有重要学术价值,并可以为临床细胞移植治疗开辟新的途径,从而成为当前研究的热点之一。综述了近年来肝源性卵圆细胞、成肝细胞、骨髓源干细胞和其他成体干细胞跨越分化为肝细胞的研究现状与进展,以及卵圆细胞、成肝细胞等的分离鉴定,表面标志、生物学特征和跨越分化机制,并对成体干细胞在肝脏疾病细胞治疗上的应用前景作了展望。     

SV40 TAg转基因小鼠模型的建立及其表达

为了建立中枢神经系统肿瘤小鼠模型,构建了大鼠神经元特异性烯醇化酶(ratneu-ron-specificenolase,NSE)基因启动子调控下的猿猴病毒40大T抗原基因(simianvirus40largeTantigengene,SV40TAg)转基因载体,通过受精卵雄原核显微注射的方法制备转基因小鼠。PCR鉴定转基因小鼠的基因型;RT-PCR和Northern印迹检测转基因阳性鼠中SV40TAgRNA水平的表达及其组织特异性;免疫组化检测其蛋白质水平的表达。经显微注射共获得9只首代转基因阳性鼠(首建者,Founder小鼠),其中2例出生时即发生神经干细胞来源的肿瘤,其他Founder小鼠经繁育后共建立了5个SV40TAg转基因小鼠系,其中有4个系检测到SV40TAgRNA水平的表达且特异性地表达于脑组织,但未检测到蛋白质水平的表达。研究表明NSE启动子活性具有较强的组织特异性,并起始于小鼠胚胎发育期;SV40TAg具有明显的致癌作用,且SV40TAg诱发的神经系统肿瘤易造成转基因小鼠早期死亡。     

四种不同高血压大鼠模型形成过程中血清抗AT1A受体自身抗体的检测

本实验采用不同的方法复制两肾-夹（two-kidney one-cliprenal hypertensive,2K1C）、神经性、DOCA-盐高血压和自发性高血压大鼠模型,观察AT1A受体自身抗体（AT1A-receptorautoantibodies,AT1A-AAs）在不同高血压发病的变化规律,同时对自身抗体生物活性进行分析。实验结果表明,在高血压发病过程中AT1A-AAs的阳性率和滴度均明显增加,在四种模型中,自发性高血压组最明显,2K1C和神经性组次之。AT1A-AAs的生物活性显示,可增加培养的新生鼠心肌细胞跳动频率和血管收缩张力。结果提示,自身免疫机制参与了高血压的形成,AT1A-AAs可能与心肌肥厚有关。     

大鼠CXCR4基因RNAi慢病毒载体的构建及其在骨髓间质干细胞中的表达

为深入研究CXCR4在骨髓间质干细胞(MSCs)体内迁移中的作用, 构建CXCR4基因RNA干扰(RNAi)慢病毒载体并实现其在大鼠MSCs (rMSCs)中表达。根据大鼠CXCR4 mRNA序列, 设计并合成包含各靶序列的互补DNA链,插入pSUPER载体的H1 RNA启动子后面, 产生pRiCXCR4, 将其中的CXCR4 shRNA表达结构酶切插入慢病毒载体质粒pNL-EGFP, 产生pNL-RiCXCR4-EGFP。在脂质体介导下与包装质粒pHELPER和包膜质粒pVSVG共转染293T细胞, 包装生产慢病毒,测定慢病毒功能滴度。慢病毒转导rMSCs后, 用Real-time RT-PCR、Western blotting和流式细胞术检测RNAi组(CXCR4a、CXCR4b和CXCR4c)、空载体组(Mock)和对照组(Control)中CXCR4表达情况。结果显示, 酶切和测序证实pRiCXCR4质粒构建正确, 产生能同时表达增强型绿色荧光蛋白(EGFP)和CXCR4 shRNA的慢病毒载体质粒pNL-RiCXCR4-EGFP, 未浓缩和浓缩慢病毒悬液的功能滴度分别为6.4×104TU/mL和6.9×106TU/mL。慢病毒转导rMSCs 48 h后, 与空载体组和空白组相比, 3个RNAi组均不同程度抑制CXCR4表达, CXCR4b-MSC组在mRNA水平抑制了95.6%, 抑制作用最明显。大鼠CXCR4基因RNAi慢病毒载体构建成功, 为深入研究CXCR4在rMSCs向损伤组织定向迁移的作用奠定了基础。     

小鼠胚胎干细胞分化为肝细胞的基因芯片分析

弄清胚胎肝脏发育的分化调节机制,对指导干细胞在肝再生中的应用以及研究肝分化相关疾病分子机制具有重要意义．胚胎干细胞的全能性使得体外建立肝向分化模型成为可能,采用单层贴壁培养方式,分阶段加入成纤维细胞生长因子(FGF)、肝细胞生长因子(HGF)、制瘤素(OSM)等因子,诱导小鼠胚胎干细胞D3(mESC-D3)的肝向分化．分化细胞在光镜和电镜下呈现肝样细胞形态,RT-PCR、细胞免疫荧光检测以及PAS染色分析表明,这些细胞具有肝细胞特征性的基因表达和生化功能．采用干细胞分化相关基因芯片比较早期肝定向分化前后的基因表达差异,结果显示,48个差异表达基因中(大于2倍),20个上调、28个下调．进一步的生物信息学分析发现,它们集中体现在细胞外基质、细胞连接、FGF、BMP分子及Notch、Wnt信号通路上,提示这些改变可能与胚胎早期的肝向分化密切相关．     

凝集素芯片技术检测糖蛋白方法的建立及初步应用

建立了凝集素芯片技术检测糖蛋白的方法,对实验条件进行了优化,应用凝集素芯片初步检测分析了Chang?蒺s liver正常肝细胞总蛋白中的糖蛋白糖链构成．将凝集素ConA、GNA固定于环氧化修饰的玻片表面,用Cy3标记标准糖蛋白RNaseB,利用凝集素识别特异糖链的原理建立凝集素芯片检测糖蛋白的方法．摸索出最佳封闭剂是含1% BSA的磷酸缓冲液,最佳孵育时间及温度为3 h和室温,最佳孵育缓冲液为含1% BSA和0.05% Tween-20的磷酸缓冲液,并用甘露糖抑制实验验证了凝集素芯片结合的特异性．用包含10种凝集素的芯片,成功解析了标准糖蛋白RNaseB、Fetuin的糖链构成,证实了凝集素芯片检测糖蛋白糖链的可行性．最后用凝集素芯片初步检测分析了Chang?蒺s liver正常肝细胞总蛋白中的糖蛋白糖链构成,发现 Chang's liver正常肝细胞总蛋白中的糖蛋白可能有多价 Sia或GlcNAc、terminalα-1,3 mannose、GalNAc、Galβ-1,4GlcNAc这些糖链结构的存在．蛋白质糖基化是一种重要的翻译后修饰,它在微生物感染、细胞分化、肿瘤转移、细胞癌变等生命活动中起着重要作用,因此近年来蛋白质的糖基化研究受到广泛的重视,但由于缺乏一种简便、快速、高通量的检测手段,蛋白质糖基化修饰的研究发展缓慢．凝集素芯片技术的出现实现了对糖蛋白的快速、准确、高通量的检测 分析．     

大鼠发情期和间情期下丘脑ghrelin mRNA的表达

为探索下丘脑ghrelin mRNA及GnRH mRNA在大鼠(Rattus norregicus)发情期和间情期的表达特点,通过外部观察和阴道涂片相结合的方法确定发情期和间情期,将12只未经产SD雌性大鼠分为2组,即发情期组和间情期组,每组6只。取动物下丘脑,用实时荧光RT-PCR方法检测ghrelin mRNA和GnRH mRNA的表达丰度。结果表明,间情期组大鼠下丘脑ghrelin mRNA的表达丰度显著高于发情期组(P<0.01);间情期组大鼠下丘脑GnRH mRNA的表达丰度显著低于发情期组(P<0.01)。研究发现,下丘脑ghrelin mRNA和GnRH mRNA在发情期与间情期具不同的表达模式,提示ghrelin可能在下丘脑水平上对GnRH mRNA的表达具下调作用。     

体外分步诱导猕猴胚胎干细胞为肝细胞

采用分阶段诱导方法模拟肝细胞体内发育,建立体外诱导猕猴胚胎干细胞（rhesus monkey embryonic stem cells, rESCs）分化为成熟肝细胞的体系,对研究以ES细胞为基础的临床替代治疗人类晚期肝脏疾病具有重要的意义。将rESCs团块在含有10% FBS的DMEM培养基中悬浮培养11d,形成含有早期内胚层细胞的拟胚体（embryonic bodies, EB）并开始表达早期肝细胞的部分基因或蛋白,将11日龄EB接种至包被有ECM的组织培养皿,分阶段加入aFGF、BMP-4及OSM。经aFGF和BMP-4诱导7～10d后,分化细胞形态变为具有双核的多角形细胞,表达早期和中期肝细胞特异性的蛋白（AFP、ALB及CK18）和基因（AFP、ALB、APOH,G-6-P及TAT）,并具有储存糖原的功能。撤除aFGF和BMP-4,添加OSM继续诱导7～10 d,分化的细胞表达成熟肝细胞所特有基因CYP1B1和ADH1C,并具有摄取靛青绿的能力。     

大鼠眶额叶皮质受损破坏新异性探索行为

利用旷场测试和Y-迷宫测试两种行为模型检测了双侧眶额叶（orbitofrontal cortex, OFC）电损伤或假损伤雄性SD大鼠的新异性探索行为, 探讨了OFC在大鼠探索新异环境中的作用。旷场测试的结果发现,OFC损伤大鼠的行走距离和直立次数较假损组有明显降低;同时,在Y-迷宫测试中与假损伤组大鼠相比,OFC损伤大鼠在新异臂的访问时间和穿梭次数明显降低。提示眶额叶皮质在大鼠新异性探索行为中起着重要作用。     

瑞舒伐他汀对压力超负荷型心肌肥厚大鼠TGF-β1表达的影响

目的:观察瑞舒伐他汀对大鼠压力超负荷型心肌肥厚的作用,并探讨其对TGF-β1表达的影响.方法:将SD大鼠随机分为5组.除假手术组外各组通过不完全结扎大鼠腹主动脉构建心肌肥厚模型,A为假手术组,B为单纯手术组,C为卡托普利组(50mg/kgod),D组为瑞舒伐他汀小剂量组(2 mg/kgod),E为瑞舒伐他汀大剂量组(4 mg/kgod),各组动物术前一周始灌胃给予相应药物直至术后4周,A、B纽给予等量生理盐水.给药第5周末,测定各组大鼠血压和心脏质量指教;采用RT-PCR法和免疫组化法检测左室心肌组织中TGF-β1mRNA和TGF-β1蛋白表达.结果:术后4周各组动物血压和HMI较A组明显增加(P<0.01或P<0.05),而C、D、E组较B组有显著下降(P<0.01或P<0.05);同时各治疗组左室心肌组织中TGF-β1 mRNA和TGF-β1蛋白表达较B组有显著下降(P<0.01),且C组抑制表达较D、E组更为显著(P<0.05或P<0.01).结论:瑞舒伐他汀可有效的缓解压力超负荷诱导的大鼠心肌肥厚,且作用类似卡托普利,其可能通过降低左室心肌TGF-β1表达,影响TGF-β信号转导产生作用.