桃红四物汤对缺糖缺氧大鼠脑微血管内皮细胞VEGF、VEGFR-2、Akt基因及蛋白表达的作用机制研究

摘要 目的：探讨桃红四物汤对缺糖缺氧（OGD）大鼠脑微血管内皮细胞（rBMECs）血管内皮生长因子（VEGF）、血管内皮生长因子受体2（VEGFR-2）、蛋白激酶B（Akt）基因及蛋白表达的影响及其作用机制。方法：取rBMECs进行培养并随机分为正常组培养、模型组培养、桃红四物汤（0.4 mg/mL）组和桃红四物汤（0.8 mg/mL）组,除正常组外,其余三组采用氧糖剥夺实验构建OGD损伤模型。桃红四物汤组在造模前1 h按0.4 mg/mL、0.8 mg/mL浓度加入桃红四物汤,而正常组及模型组则加入等量体积生理盐水。实时定量聚合酶链反应（qRT-PCR）、蛋白免疫印迹试验检测VEGF、VEGFR-2、Akt基因及蛋白表达情况。结果：与正常组比较,模型组细胞凋亡率显著升高（P＜0.05）。与模型组比较,桃红四物汤（0.4 mg/mL）组和桃红四物汤（0.8 mg/mL）组均降低,且以桃红四物汤（0.8 mg/mL）组最为显著（P＜0.05）。与正常组比较,模型组rBMECs中Akt、VEGFR-2、VEGF相对mRNA和蛋白表达水平显著升高（P＜0.05）。与模型组比较,桃红四物汤（0.4 mg/mL）组和桃红四物汤（0.8 mg/mL）组显著降低,且以桃红四物汤（0.8 mg/mL）组最为显著（P＜0.05）。结论：桃红四物汤可能通过降低OGD条件下rBMECs中VEGF、VEGFR-2、Akt基因及蛋白表达水平,从而发挥抑制内皮细胞的凋亡,保持内皮细胞的完整性,这可能是桃红四物汤对脑保护的机制之一。     

基于网络药理学探究芍药苷治疗糖尿病视网膜病变的机制

本研究通过体外实验与网络药理学相结合的方法分析芍药苷治疗糖尿病视网膜病变的相关作用机制。制备高糖环境下视网膜血管内皮细胞的体外模型,探究芍药苷对糖尿病视网膜病变的保护作用;从TCMSP、 UniProt、 PubChem、 PharmMapper、 SwisstargetPrediction、 GeneCards、 OMIM、 DrugBank、 TTD数据库获取芍药苷和糖尿病视网膜病变的作用靶点,使用韦恩图获取核心靶点;基于STRING数据库,采用Cytoscape构建蛋白质-蛋白质相互作用网络和“药物-靶点-疾病”网络;应用DAVID数据库对核心靶点进行GO功能富集分析和KEGG通路富集分析,并用AutoDock软件将芍药苷与核心靶点进行分子对接验证。体外实验结果显示,芍药苷能显著抑制视网膜血管内皮细胞的增殖,降低其迁移能力并减少管腔形成长度。网络药理学结果显示共获取芍药苷治疗糖尿病视网膜病变的核心靶点154个,其中度值较高的靶点包括VEGFA、 IL6等。GO功能共富集到705个GO条目,主要涉及细胞对药物的反应、血管内皮细胞迁移的调节、细胞增殖的调节等生物过程;KEGG通路富集...     

miR-31通过下调FIH和上调VEGF-A/VEGFR-2促进大鼠主动脉内皮细胞增殖

目的 探讨miR-31对大鼠主动脉内皮细胞（rat aortic endothelial cells, RAECs）增殖的影响及其潜在的作用机制。方法 分离RAECs,鉴定为目的细胞后,观察miR-31激动剂（miR-31 agomir）和抑制剂（miR-31 antagomir）对RAECs增殖以及缺氧诱导因子抑制因子（hypoxia inducible factor inhibitor, FIH）、血管内皮生长因子A(vascular endothelial growth factor A, VEGF-A)和血管内皮生长因子受体2(vascular endothelial growth factor receptor 2, VEGFR-2)水平的影响。通过CCK-8实验测定miR-31对细胞增殖能力的影响,qRT-PCR检测细胞中miR-31的相对表达水平,Western blot检测细胞中FIH、VEGF-A和VEGFR-2水平。结果 在无特殊器械、不添加营养因子的情况下成功培养出RAECs;转染miR-31 agomir显著促进RAEC的细胞增殖,降低FIH水平,上调VEGF-...     

晚期糖化终产物诱导内皮细胞通透性增高

本文探讨了晚期糖化终产物(advanrced glycation end products,AGEs)修饰蛋白对内皮细胞通透性及细胞骨架肌动蛋白的形态学影响,以及特异的AGEs受体(receptors for AGEs,RAGE)、氧化应激和p38 MAPK通路在此病理过程中的作用。用不同浓度的AGEs修饰人血清白蛋白(AGE-HSA)与人脐静脉内皮细胞株ECV304在体外共同培养不同时间,并设立对照组进行比较,采用TRITC荧光标记白蛋白漏出法测定单层内皮细胞的通透系数Pa值,荧光染色法示细胞骨架的形态学改变。与对照组相比,AGE-HSA以时间和剂量依赖的方式引起单层内皮细胞通透性的升高及细胞骨架肌动蛋白F-actin形态的改变;可溶性RAGE的抗体(anti-RAGE IgG)、NADPH氧化酶抑制剂(apocynin)及p38抑制剂SB203580均可减轻AGEs对内皮细胞屏障功能和形态的影响。结果提示,AGEs修饰蛋白对单层内皮细胞通透性及骨架重排的作用可能通过与内皮细胞上的RAGE结合,引起细胞内的氧化应激,并激活p38 MAPK通路所介导。     

罗格列酮对胰岛素抵抗高血压大鼠主动脉功能的影响

为探讨罗格列酮(rosiglitazone,ROSI)对胰岛素抵抗高血压大鼠(insulin resistant-hypertensive rats,IRHR)主动脉功能的影响及其可能机制,用高果糖饲养Sprague-Dawley大鼠8周,制备IRHR模型,并通过相关指标的检测判断造模是否成功。随后采用血管环灌流方法,观察各实验组动物离体胸主动脉环对新福林(L-phenylephrine,PE)、氯化钾(KCl)的收缩反应和对乙酰胆碱(acetylcholine,ACh)、硝普钠(sodium nitroprusside,SNP)的舒张反应：以及用一氧化氮合酶(nitric oxide synthase,NOS)的抑制剂N-硝基-L-精氨酸甲酯(N^ω-nitro-L-arginine methyl ester,L-NAME)预孵育血管30min后,主动脉环对ACh的舒张反应：同时对各实验组血清一氧化氮(nitric oxide,NO)的含量进行测定。结果显示：(1)罗格列酮能降低IRHR的收缩压、血清胰岛素水平,改善胰岛素抵抗。(2)高果糖组动物主动脉对PE、KCl的收缩反应明显增强,对ACh的舒张反应明显减弱,ROSI可逆转上述作用。(3)用L-NAME预处理后,高果糖组动物主动脉对ACh的舒张反应进一步减弱,ROSI可部分对抗上述作用。(4)各组大鼠离体主动脉对SNP的舒张反应无显著性差异。(5)ROSI对对照组大鼠主动脉功能的影响不明显。(6)与对照组相比,高果糖组动物血清NO含量显著降低,用ROSI处理后,血清NO含量显著增加。上述结果表明,ROSI能改善IRHR主动脉的舒张功能,其作用的机制可能是部分通过NOS途径促进内皮NO释放,或是通过降低血压、血清胰岛素水平,以及改善胰岛素抵抗等作用,导致血管舒张。     

树鼩脑微血管内皮永生化细胞系的建立及最适D-半乳糖浓度诱导BMECs衰老细胞模型的探讨

目的 建立树鼩永生化脑微血管内皮细胞(brain microvascular endothelial cells, BMECs),明确D-半乳糖对BMECs衰老的影响，探索其潜在机制。方法 用携带SV40T基因的慢病毒转染BMECs,传至50代后进行形态观察、生长曲线测定以及免疫荧光和核型鉴定；再用不同浓度D-半乳糖(D-galactose, D-gal)诱导BMECs,通过细胞增殖实验确定最适诱导条件，用衰老相关β半乳糖苷酶染色分析细胞衰老情况，Western Blot检测衰老相关蛋白p53的表达水平，超氧化物歧化酶和脂质氧化检测试剂盒检测细胞内氧化应激水平。结果 永生化的细胞生长状态较好，不同代次的细胞形态一致，单个细胞呈短梭形或多角形，整体呈典型的铺路石状；细胞生长曲线显示细胞数量在第2～5天时处于对数生长期，在第6天时达到高峰，之后缓慢增长进入平台期；免疫荧光显示该细胞特异蛋白vWF和CD31及永生化基因SV40T为阳性；细胞核型结果显示永生化细胞染色体数目与滇西亚种树鼩的染色体数量相符；D-gal诱导BMECs抑制细胞增殖，有时间和浓度依赖性；实验组，即浓度为10 g/L的D...     

树鼩视网膜微血管内皮细胞永生化细胞株的建立及鉴定

目的 建立树鼩视网膜来源的微血管内皮细胞的体外分离培养技术以及永生化细胞株，为体外利用树鼩视网膜微血管内皮细胞开展相关研究提供新的实验材料。方法 利用Ⅱ型胶原酶、分散酶和DNaseⅠ酶消化法分离培养出原代视网膜微血管内皮细胞，利用差速消化法纯化内皮细胞，然后利用携带SV40T基因的慢病毒转染细胞，再挑取单克隆后进行传代培养。对传至50代以上的细胞进行形态学观察、免疫荧光鉴定以及核型鉴定。结果 采用混合酶消化法能够分离获得微血管内皮细胞，纯化后的细胞呈不规则多角形和梭形。经慢病毒转染后的细胞传代培养后细胞形态一致，到第50代时细胞形态结构仍较好。细胞免疫荧光结果显示标志性蛋白VWF、CD34、Claudin1、ZO-1和永生化SV40T表达阳性。生长曲线结果显示：细胞生长旺盛，第2～4天时处于对数生长期，第4天进入平台期。细胞核型结果显示：染色体数与树鼩染色体相同，即所获取的细胞为永生化的树鼩视网膜微血管内皮细胞。结论 成功建立的树鼩视网膜微血管内皮细胞永生化细胞株具有较好的形态结构与功能，为视网膜病变及眼科相关疾病的研究提供了新的实验材料。     

血管内皮细胞在主动脉瘤发展中作用的研究进展

主动脉瘤(aortic aneurysm)是以动脉出现永久性扩张为特征的一类血管疾病，常发生于肾下以及胸近端区域，破裂后十分凶险。目前主动脉瘤的治疗方式局限于手术干预，且尚未发现有效治疗药物，因此，寻找有效的干预靶点成为主动脉瘤治疗的新思路。近年来的研究表明，血管内皮细胞(endothelial cell)在受到外界环境刺激后可发生氧化应激、炎症反应及屏障功能破坏，而这些均可能参与动脉瘤的发生发展。随着内皮细胞在动脉瘤中的重要作用逐渐被揭示，基于内皮细胞为靶点进行干预也取得了较多的研究进展。本文重点综述了内皮细胞在主动脉瘤发生发展中的具体作用机制及以内皮细胞为靶点的动脉瘤治疗方法，旨在为临床干预主动脉瘤进程提供参考。